【摘 要】
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实验方法：基因敲除:构建同源重组质粒(同源左臂477bp,抗性基因(tet)1300bp,同源右臂471bp),以同源重组的原理进行木糖操纵子(xyl operon)的调控基因xylR的敲除.过表达:采用原
【出 处】
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全国农业生物化学与分子生物学第十四届学术研讨会
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实验方法：基因敲除:构建同源重组质粒(同源左臂477bp,抗性基因(tet)1300bp,同源右臂471bp),以同源重组的原理进行木糖操纵子(xyl operon)的调控基因xylR的敲除.过表达:采用原核高效表达系统pGEX-4T-2,在Klebsiella oxytoca HP1中分别过表达K.oxytoca HP1木糖代谢途径中的两个过程酶-转醛醇酶(TAL,954bp)和转酮醇酶(TKL,1902bp),由IPTG诱导.
结果：经测序基因敲除菌株K.oxytoca HP1/△xylR，过表达菌株K.oxytoca HP1/TAL,K.oxytoca HP1/TKL均构建正确;经SDS-PAGE检测，TAL和TKL正确过表达，且最佳诱导条件为:300℃，IPTG=1.0 mmol/L。在纯木糖及混合糖发酵过程中，过表达菌株K.oxytoca HP1/TAL,K.oxytoca HP1/TKL在THY,THY和HYPM三大指标上与野生型K.oxytoca HP1相比，略有提高但总体幅度较小，说明过表达TKL和TAL并未有效地提高暗发酵木糖的产氢效率。然而，基因敲除菌株K.oxytocaHP1/△xylR相比于野生型K.oxytoca HP1在THY, THY和HYPM三大指标上有明显地提升，特别是在HYPM方面分别提高了17.86％(PG),91.21%(X/G(3:1)),78.00%(X/G(1:1))和44.62%(X/G(1:3)).
结论：xylR在K.oxytoca HP1的木糖操纵子中起负调控的作用，当其被敲除后，提高了木糖操纵子中的两个结构基因xylA(编码木糖异构酶)和xylB(编码木酮糖激酶)的表达水平，从而在很大程度上削弱了混合糖中葡萄糖抑制效应对木糖利用的阻遏，进而提高了混合糖的整体氢转化率。本研究对克服木质纤维素水解液暗发酵中的木糖利用率低的瓶颈，提高整体的暗发酵产氢效率具有重要的意义。
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