【摘 要】
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目的:在中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)中异源表达,获得活性人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A3(UGT1A3),并以已知底物槲皮素为底物测定该异源表达酶的体外活性.方法:人肝组织的总RNA经TRIzol试剂提取获得总RNA.以此为模反,以基因特异性引物经逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)获得全长UGT1A3基因.该序列经纯化,添A等步骤后与克隆载体相连并测序.正确的序列通过亚克隆过程连入哺乳动物表达
【出 处】
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第七届全国青年药学工作者最新科研成果交流会
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目的:在中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)中异源表达,获得活性人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A3(UGT1A3),并以已知底物槲皮素为底物测定该异源表达酶的体外活性.方法:人肝组织的总RNA经TRIzol试剂提取获得总RNA.以此为模反,以基因特异性引物经逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)获得全长UGT1A3基因.该序列经纯化,添A等步骤后与克隆载体相连并测序.正确的序列通过亚克隆过程连入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+),并转化入大肠杆菌系DH5α进行筛选.鉴定正确的重组子用磷酸钙法转染至中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)中,以新霉素类似物(G418)进行为期3周的筛选.转染成功的CHL细胞产生UGT1A3蛋白,该蛋白在mRNA水平的转录通过RT-PCR验证.超声破碎CHL细胞并离心获得含有重组UGT1A3的蛋白,用于催化槲皮素的葡糖醛酸缀合反应.该体外缀合体系包括了反应需要的各种物质;Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、MgCl<,2>、UDPGA、Brij58、UGT1A3蛋白、D-葡萄糖二酸1,4-内酯、尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDPGA)和槲皮素.孵育条件经预实验优化.该缀合反应的代谢物由带有二有管阵列检测器(DAD)的反相高效液相(RP-HPLC)系统分析.代谢物的身份通过β葡糖醛酸酶水解反应证明是槲皮素的葡糖醛酸缀合物.活性检测过程中同时做不加UDPGA或不加S9或不加槲皮素的空白试验,未转染的CHL细胞的S9蛋白被用于对照实验.结果:获得了UGT1A3-3全长基因.正确的基因片段被成功亚克隆入pcDNA3.1(+).经过G418的筛选,得到了几个成功转染的单克隆.RT-PCR分析表明,重组UGT1A3在mRNA水平有转录.以槲皮素为底物的葡糖醛酸活性测定和HPLC分析显示,异源表达于CHL细胞的重组UGT1A3酶有活性.结论:获得了正确的UGT1A3基因序列,并在CHL细胞中获得异源表达.该蛋白经活性测定可以催化槲皮素的葡糖醛酸缀合反应.
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