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目的 采用siRNA技术靶向沉默软骨细胞leptin受体Ob-Rb基因表达,抑制前炎性因子的表达及leptin下游信号传导,最终抑制关节软骨破坏,从而为临床OA的基因治疗提供实验基础及新思路.方法 取全膝关节置换术的OA患者股骨髁及胫骨平台关节软骨.标本取下后立即分离消化得到关节软骨细胞,用含20％胎牛血清(FBS)的常规培养基培养.原代培养细胞生长融合率达90％以上进行1∶3传代培养操作,倒置显微镜下观察各代细胞形态学特征,同时准备细胞爬片对各代细胞Ⅱ胶原免疫组化染色、甲苯胺蓝染色及番红O染色行细胞鉴定.1) 通过生物信息学获得人leptin受体Ob-Rb的基因序列,设计靶向Ob-Rb基因的siRNA(设计合成3组)2)优化转染条件,摸索对人关节软骨细胞最佳的转染条件3)人软骨细胞转染a、实验分组,在软骨细胞培养到70-80％聚集时进行转染组一、将3组Ob-Rb siRNA转染关节软骨细胞组二、相应阳性对照siRNA转染关节软骨细胞组三、相应阴性对照siRNA转染关节软骨细胞组四、关节软骨细胞空白对照组,不加任何转染试剂采用RT-PCR和实时荧光定量PCR (Q-PCR)技术筛选出Ob-Rb沉默效果最好的一组siRNA进行后期实验(实验分组同前).b、各组分别在转然后24、48、72小时应用Q-PCR/Western Blot检测Ob-Rb基因mRNA及蛋白的表达量、应用Western Blot检测collagen Ⅱ基因的蛋白表达量、应用RT-PCR检测前炎性因子基因(INFγ,NO、IL-1β、和MMP-1)的mRNA表达量.结果 经过筛选得出siRNA1的沉默效果是最好的.转染后实验组与对照组比较不同时间点Ob-Rb的mRNA及蛋白较表达均有降低,四种前炎性因子的mRNA也有不同程度的下降,而collagen Ⅱ的蛋白表达量则有不同程度的上升.结论 采用siRNA可下调OA患者膝关节软骨细胞Ob-RbmRNA及蛋白表达量,并阻断leptin对下游前炎性因子的诱导作用,促进collagen Ⅱ的合成,减轻关节软骨的破坏,为OA的治疗提供了潜在的新思路.