论文部分内容阅读
目的:本课题的研究目的是分析组蛋白甲基化H3K27me3在BPA致MIH中的调控作用,研究关键组蛋白修饰因子EZH2调控DESCs命运选择关键基因E-Cadherin表达的表观遗传学机制,从而完善环境因素(BPA)影响牙釉质发育的表观遗传学机制。方法:孕鼠BPA暴露诱导子代小鼠切牙牙釉质发育缺陷构建MIH动物模型。收集小鼠唇侧颈环上皮和DESCs。使用高通量测序建立全基因组表达图谱和组蛋白修饰(H3K27me3)图谱。选择H3K27甲基转移酶EZH2及E-Cadherin为研究对象。qRT-PCR和western blot检测EZH2及E-Cadherin的表达水平。功能获得及缺失性实验分析其在釉质发育中的作用机制。CHIP-qPCR检测E-Cadherin启动子区域H3K27me3及EZH2的富集状态。结果:小鼠母体围产期BPA暴露致使子代小鼠釉质出现釉质发育缺陷表型,提示小鼠MIH模型构建成功。MIH小鼠切牙唇侧颈环DESCs的自我更新及增殖活性出现异常增强。此外,免疫组化实验结果显示H3K27me3在MIH小鼠唇侧颈环处的富集水平明显提高。ChIP-seq结果同样显示MIH小鼠H3K27me3在基因启动子区的富集水平明显高于对照小鼠。聚类分析发现启动子区H3K27me3信号变化基因共4067个,其中H3K27me3富集上升基因3649个,提示H3K27me3在牙釉质发育过程中具有重要的调控作用。此外,ChIP-seq与RNA-seq结果联合分析发现启动子区H3K27me3富集水平与DESCs特定调控基因(如Bmi1、Sox2、Gli1和E-Cad)的表达也呈负相关。因此,我们检测了H3K27me3的甲基转移酶EZH2在MIH小鼠中表达,发现其表达与H3K27me3表达水平一致,在MIH小鼠中均出现明显上升。EZH2表达水平的上调可能由ERα调节。EZH2敲低(siRNA)可以降低BPA暴露所致的E-Cadherin启动子区域EZH2和H3K27me3富集水平,表明EZH2介导的H3K27me3参与调控E-Cadherin转录,进而调控DESCs的命运选择。结论:环境内分泌干扰物BPA通过ERα上调EZH2介导的H3K27me3在基因组的富集水平,特别是牙釉质发育关键基因E-Cadherin,进而抑制E-Cadherin转录,上调DESCs自我更新及增殖活性,最终导致MIH发生。