【摘 要】
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里氏木霉(Trichoderma reesei)cbh1是在丝状真菌中表达异源基因的常用启动子,但是该启动子存在多处碳代谢阻遏(CCR)蛋白CRE1的结合位点(5-SYGGRG-3),导致在某些条件下表达强度不够.除了强启动子能够提高转录之外,分泌蛋白的成功表达还取决于mRNA的稳定性以及防止ERAD途径的水解.本研究尝试将启动子三处CRE1结合位点分两次定点突变：第一轮将-724处突变成转录激活
【机 构】
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中科院上海植物生理生态研究所,上海 200032
【出 处】
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中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会
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里氏木霉(Trichoderma reesei)cbh1是在丝状真菌中表达异源基因的常用启动子,但是该启动子存在多处碳代谢阻遏(CCR)蛋白CRE1的结合位点(5-SYGGRG-3),导致在某些条件下表达强度不够.除了强启动子能够提高转录之外,分泌蛋白的成功表达还取决于mRNA的稳定性以及防止ERAD途径的水解.本研究尝试将启动子三处CRE1结合位点分两次定点突变：第一轮将-724处突变成转录激活因子ACE2(5-GGCTAA-3),第二轮突变将-698和-690两处突变成Hap蛋白复合体的结合位点(5,-CCAAT-3).用eGFP作为报告基因,发现突变后启动子在纤维素酶合成分泌诱导条件下,eGFP表达量在一次突变的启动子下增加了44％,eGFP表达量在二次突变后的启动子下则增加了191.88％.在工业生产中,为了提高纤维素水解速率往往采用较高的反应温度,因此提高木霉酶系的热稳定性显得十分重要,我们尝试将热酸菌(Acidothermus cellulolytics)的耐高温型内切酶基因e1直接转入以上表达系统,尽管从cDNA中检测到e1基因的表达,但在胞内和发酵液中都无法检测到对应的编码蛋白质.我们将el与cbhI通过刚性链接肽和柔性链接肽融合后转入以上表达体系中进行异源表达,在发酵液中可以检测到大量目的蛋白.进一步分析发现不同融合方式并不影响这两种融合蛋白的表达分泌量,但却影响两种融合蛋白的酶活及热稳定性,即,刚性链接肽的融合蛋白在酶活及热稳定性方面均优于柔性链接肽的融合蛋白.两种融合蛋白的相应转化子发酵液的酶活及对预处理秸秆的水解效率都有不同程度增加.刚性链接肽的融合蛋白所对应的转化子的租酶液,在60℃时,滤纸酶FPU和CMC酶活分别提高了38.02％和29.96％,而在50℃时,相应的酶则分别提高了13.84％和15.51％.这说明EI在里氏木霉中的成功表达,不仅提高了其分泌蛋白中的纤维素酶的酶活,也提高了其热稳定性.利用刚性链接肽和柔性链接肽两类融合蛋白所对应的转化子水解经过稀酸预处理的玉米秸秆(PCS)时,发现其水解PCS 24h后还原糖量比野生株分别提高了39.500和29.53％.以上研究结果说明,在表达体系改造中,启动子的改造和融合基因等其他表达策略的优化对提高异源基因表达效率及其蛋白的活性都是十分重要的.
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