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背景：目前固相核酸检测多以玻璃作为载体,其检测过程需要对DNA 探针进行化学基团修饰,造成该种检测方法的成本较高.尼龙膜是一种传统固相载体,其本身携带正电荷,可有效固定带负电荷的DNA 分子.尼龙膜用作固相载体时,无需对需固定的DNA 分子进行任何化学基团修饰,该种核酸固定方法不仅操作简单快捷,而且成本低廉.此外,用玻璃片基固定核酸时,玻片片基本身也需化学基团修饰,因此玻璃片基的检测成本远高于尼龙膜.因此,发展基于尼龙膜固相载体的核酸检测新技术仍具有其显著的优势.滚环扩增(RCA)是一种高灵敏性等温DNA 扩增技术,它具有恒温低温扩增和高灵敏性的优势.近红外荧光(near infrared fluorescence,NIRF)技术具有普通荧光所不具备的背景低、信噪比高、穿透力强等显著优势,因此在生物检测领域成为未来的趋势.本实验利用尼龙膜、RCA 及NIRF的材料及技术优势,欲建立一种操作程序简单、灵敏度高的核酸分子检测新方法.方法：(1)材料：选择一序列已知的核酸分子作为检测靶标(Target,T),选择另一序列已知的核酸分子作为检测的阴性对照分子(Negative control,NC)；设计检测探针,使其含有与靶标分子特异性杂交序列与滚环扩增引物(Primer,P)序列；设计开环锁式寡核苷酸(rolling circle,RC)及滚环连接子(RC linker)以制备滚环分子.(2)滚环制备：将RC分子与滚环连接子溶解在寡核苷酸复性缓冲液中,等体积混合；95℃孵育5 min,自然降至室温；加入T4连接酶进行连接反应.(2)靶标固定：检测靶标及阴性对照核酸分子以每点0.3 μL点到2 cm×2 cm的正方形状尼龙膜上,稍干燥后将尼龙膜放入紫外交联仪中交联6 min；检测靶标点样浓度分别是10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032及0.00064 μM,阴性对照核酸分子的点样浓度为2 μM.(3)滚环检测：将尼龙膜置于1×封闭液中,37℃封闭30 min,用PBS洗涤2 min；在1.5 mL EP管中配制好杂交体系(含有滚环扩增引物的杂交液),将尼龙膜移入其中,在杂交炉中50℃杂交2 h；杂交结束后将膜取出用PBS洗涤2次,每次2 min；将尼龙膜转移至杂交盒中的玻片上,将配制好的RCA反应体系(包含Biotin-dUTP、dNTP、φ29 DNA聚合酶及缓冲液)加到尼龙膜上,封闭杂交盒,再将杂交盒放入30℃水浴孵育2 h；反应结束后用PBS洗涤尼龙膜2 次,每次2 min ； 将尼龙膜置于1：15000 稀释的链霉亲和素(streptavidin-800CW)溶液,室温反应30 min；用PBS洗涤尼龙膜2次,每次5 min；用近红外荧光成像仪扫描成像.结果：检测原理如图1,此方法的关键是论证RCA 反应是否可在尼龙膜上发生.检测结果如图2,可见靶标分子被成功检测,且呈现定量特征(梯度荧光信号),而阴性对照核酸分子未被检测出(无荧光信号)；靶标分子的最低检测限为9.6 fmol(0.0032 μM × 0.3 μL).检测结果的量化见图3,可见在检测的靶标浓度中,荧光信号与靶标浓度的相关系数(R2)达0.9658,检测线性范围为3 pmol～9.6 fmol.结论：本研究首次证明了滚环扩增可在尼龙膜载体上进行,并籍此建立了一种检测核酸分子的新方法.该方法具有较高的灵敏度,且能定量检测核酸分子.