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目的 AML1-ETO是具有t(8；21)的AML-M2白血病细胞中最常见的融合基因,为研究AML1-ETO在白血病发生中的致病机理,构建pcDNA3.1-AML1-ETO真核表达载体,观察融合蛋白在U937细胞内表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.研究AML1-ETO对抗凋亡基因Bcl-2、髓系分化相关基因C/EBPα和抑癌基因p14ARF表达的影响及其表观遗传学调控机制.方法 以原核表达载体pCMV5-AML1-ETO为模板扩增AML1-ETO目的片段,将该基因重组于pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体上,用脂质体转染技术将其导人到U937白血病细胞,经G418筛选获得稳定转染的克隆,PCR检测AML1-ETO基因的整合,RT-PCR及Western blot检测AML1-ETO基因mRNA和蛋白的表达,应用锥虫蓝拒染人工计数法观察AML1-ETO对细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测髓系分化抗原表达的变化,瑞特染色法观察细胞形态学改变.荧光实时定量PCR检测细胞系及t(8；21) AML患者Bcl-2、C/EBPα和p14 mRNA的表达水平.染色质免疫沉淀技术(ChIP)观察转染细胞中AML1-ETO与Bcl-2、C/EBPα和p14ARF基因启动子之间直接的相互作用情况以及AML1-ETO对Bcl-2、C/EBPα和p14ARF基因所处染色质组蛋白乙酰化、甲基化水平的影响.结果 pcDNA3.1-AML1-ETO经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,筛选出AML1-ETO基因高表达的亚克隆,证实AML1-ETO基因稳定转染到U937细胞中并得到表达；转染细胞生长受抑(P＜0.05),髓系分化抗原CD11b表达阳性率[(4.17±0.31)％]低于对照组[(11.40±0.17)％、(11.03±0.15)％](P＜0.001),CD14表达阳性率[(3.03±0.15)％]低于对照组[(5.90±0.20)％、(5.80±0.20)％](P＜0.01),形态呈低分化表现.与对照组相比,在转染了AML1-ETO的U937细胞系和t(8；21) AML患者中,Bcl-2,C/EBPα和p14ARF的mRNA表达均下调(P＜0.001).染色质免疫沉淀实验证明转染细胞沉淀富集的DNA中含有Bcl-2、C/EBPα和p14ARF基因的启动子序列.转染细胞Bcl-2、C/EBPα和p14ARF启动子组蛋白H3、H4乙酰化水平明显降低(P＜0.01),组蛋白H3K9、H3K27三甲基化水平显著升高(P＜0.01),同时伴有甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)的富集(P＜0.01).结论 成功构建pcDNA3.1-AML1-ETO表达载体,并在真核细胞中得到了正确表达；AML1-ETO基因能抑制U937细胞的增殖与分化；AML1-ETO能下调Bcl-2、C/EBPα和p14ARF的表达；Bcl-2、CEBPα和p14ARF是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO导致的Bcl-2、C/EBPα和p14ARF基因的表观遗传学沉默可能是AMLM2b型白血病的发病机制之一.