目的:建立热应激下评价NLRP3炎症小体活性的细胞模型与动物模型。方法:(一)细胞实验。(1)确定热应激激活NLRP3炎症小体的最佳实验条件为40℃,4 h。在此基础上,建立热应激下评价NLRP3炎症小体活性的细胞模型。实验分为四组:空白对照组、热应激组、LPS组、LPS+热应激组。各组给予相应处理后,收集细胞培养液上清,ELISA法测定炎症因子IL-1β的浓度。提取各组细胞总蛋白,Western Blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化,包括NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β。(2)提取各组细胞total RNA,Real-Time PCR检测NLRP3炎症小体相关组分基因NLRP3、ASC、Caspase-1的表达变化。(二)动物实验。(1)C57BL/6小鼠分为正常对照组、热应激组、LPS组、LPS+热应激组。热应激组小鼠放入40℃高温模拟仓(湿度60%±5%)中给予热应激,LPS组小鼠腹腔注射LPS,LPS+热应激组小鼠腹腔注射LPS 4 h后放入40℃高温模拟仓(湿度60%±5%)中给予热应激。以LPS+热应激组小鼠濒死时间为终止时间,然后取血制备血清,ELISA法测定IL-1β的含量。(2)同时取上述各组实验动物的脑组织,提取各组脑组织总蛋白,Western Blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化,包括NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β。(3)C57BL/6小鼠分为正常对照组、热应激组、LPS组、LPS+热应激组。给予相应处理后做生存分析。记录各组小鼠的死亡时间,绘制动物生存曲线。结果:(一)细胞实验。(1)不同温度不同时间点细胞培养液上清IL-1βELISA结果显不,LPS+热应激组(40℃,4 h)IL-1β分泌水平较其它温度以及时间点有显著升高(P<0.05),故后续研究选择40℃,4 h作为热应激实验条件。(2)四组细胞培养液上清IL-1βELISA结果显示,空白对照组、LPS组、热应激组的细胞上清IL-1β含量均较低,在基础水平,而LPS+热应激组细胞培养液上清IL-1β含量较其它三组显著升高(P<0.05)。WesternBlot结果显示,与空白对照组相比,LPS+热应激组NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白表达水平均升高。(3)PCR结果显示,LPS+热应激组与其它三组相比,NLRP3、ASC和Caspase-1基因表达水平显著升高(P<0.05)。表明经LPS预处理后,40℃孵育4 h可以激活小鼠原代腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体。(二)动物实验。(1)LPS+热应激组与其它三组相比,IL-1β分泌水平显著升高(P<0.05)。(2)脑组织Western Blot提示,与空白对照组相比,LPS+热应激促进了小鼠脑组织中NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β蛋白的表达(3)生存分析表明LPS+热应激组动物生存时间较其它三组显著降低(P<0.05)。结论:经LPS预处理后,热应激可以激活小鼠原代腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体,促进NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白的表达,以及IL-1β的分泌;NLRP3、ASC和Caspase-1基因表达水平的上调。小鼠接受40℃热应激后,血清IL-1β水平升高,脑组织中NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β蛋白的表达上调。以上结果表明,LPS+热应激在细胞水平和整体动物水平均可激活NLRP3炎症小体。