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背景:维生素D(vitamin D, VD)是人体必需的一种脂溶性维生素,其与人体密切相关的是维生素D2(vitamin D2,麦角钙化醇)和维生素D3(vitamin D3,胆钙化醇)两种形式。VD3在肝脏中转化成25-(OH)D3,VD2转化为25-(OH)D2,这两种VD的代谢物被称为25-(OH)D,是VD在体内的稳定储存形式。LC-MS/MS目前被认为是生物样本中维生素D类物质测量的"黄金标准技术",与基于免疫分析的方法相比,LC-MS/MS测量方法的广泛应用提高了特异性,节约了成本。然而,该技术仍然存在一些局限性,主要与维生素D代谢物的低循环水平和大动态范围有关,从皮摩尔到纳摩尔水平跨越几个数量级,以及维生素D类物质分子具有亲脂性,缺乏适当的可以进行有效电离的功能基。本研究针对已有方法的不足,采用SLE(Supported Liquid Extraction)萃取技术,结合经典的PTAD(4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione)衍生化,并利用甲胺进一步提高衍生化合物的电离效率,建立了VD3、VD2、25-(OH)D3和25-(OH)D2的检测方法。方法:样品制备包括利用有机溶剂解离血浆蛋白结合的维生素D类物质、用SLE萃取解离的维生素D类物质和PTAD衍生化三个步骤。样品前处理后,使用反相C18闪柱进行高速色谱分离,正离子电喷雾电离-串联质谱进行检测。同时使用对应的氘代物作为内标,确保方法的准确度和可靠性。结果:分别使用替代基质(BSA)以及血浆加标样品对所建立的方法进行了方法学验证,结果表明VD3和25-(OH)D3的线性范围为1-100ng/mL,VD2和25-(OH)D2的线性范为0.1-10ng/mL,4种分析物在线性范围内线性良好。以BSA作为替代基质进行的方法学考察中,批内和批间准确度分别为86.45%-111.69%和87.94%-106.28%;精密度分别为≤14.9%和≤12.27%。4种分析物的回收率基本与对应内标的一致,基质效应91.03%-109.43%。且样品制备后稳定性和冻融稳定性及短期和长期稳定性均满足要求。以血浆加标样品进行方法学考察中批内和批间准确度分别为88.31%-113.14%和92.32%-109.46%,精密度分别为≤14.9%和≤12.27%。血浆加标后进行的稀释效应考察中准确度和CV值以及用两种基质进行考察的样品制备后稳定性和冻融稳定性及短期和长期稳定性均满足要求。讨论:本方法的灵敏度和准确度受到多个因素影响,最主要的影响因素是(1)最大程度的破坏待测物的血浆蛋白结合:SLE萃取之前,生物样本以异丙醇水溶液(50:50:,v/v)进行前处理,比纯乙腈或者以异丙醇水溶液(10:90:,v/v)等进行前处理获得的分析物响应要好很多;(2)PTAD的衍生化条件:含1.5%甲酸的乙腈溶液作为溶剂溶解PTAD衍生化试剂后与分析物的纯溶液进行衍生化反应的响应结果最好,而碱性条件下抑制衍生化后的响应。结论:本实验将SLE和PTAD衍生化相结合,通过条件优化,建立了一种全新、准确、快速的人血浆中VD3、VD2、25-(OH)D3和25-(OH)D2的检测方法,能够满足临床高通量生物样品的检测要求。