论文部分内容阅读
目的 利用核糖体展示技术筛选农兽药特异模拟抗体,为农兽药的快速现场检测提供高特异性检测抗体。方法 PCR法全基因合成优化后的BBP基因,设计包含16个随机突变位点的引物,重叠引物延伸法合成基于脂运载蛋白骨架的模拟抗体库,同时采用重叠PCR技术将核糖体展示所必需的全部组件进行拼接,构建核糖体展示脂运载蛋白模拟抗体库。采用大肠杆菌体外转录翻译系统对将构建的模拟抗体文库进行体外转录和体外翻译后,产生了模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体文库。分别以农药久效磷、百草枯和兽药地西泮、雌二醇和为靶标,固相亲和方法和固液相交叉亲和筛选特异结合模拟抗体。通过改变Mg2+浓度将筛选得到的模拟抗体-核糖体-mRNA三联体解离,得到模拟抗体对应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库并重新引入核糖体展示元件进行下一轮淘筛。通过多轮生物淘筛,抗原阳性的模拟抗体得到富集,最终获得高特异性模拟抗体。将该抗体序列在大肠杆菌中进行高效表达,经Western blot验证是否为目标抗体。竞争ELSIA方法测定模拟的抗体对靶标的特异结合活性、检测限与检测范围,表面等离子共振分析测定模拟抗体的亲和常数。结果 成功构建了核糖体展示脂运载蛋白随机突变模拟抗体库,该文库可以进行体外转录和翻译,在此基础上通过多轮生物淘筛,获得了百草枯、久效磷和雌二醇、地西泮等农兽药的特异性模拟抗体4种,在大肠杆菌中实现了模拟抗体高效表达,SDS-PAGE分析表明,抗体在大肠杆菌中主要以可溶性形式存在,目的蛋白占菌体破碎后上清的15％ ～25％,经金属螯合层析纯化,获得了模拟抗体纯化制品,纯度≥95％,直接ELISA检测结果表明,抗体仅与相应的小分子特异结合,与结构和功能类似物交叉反应率低于10％,竞争ELISA结果表明,模拟抗体对靶标的检测限在ppm-ppb级,检测范围2～3个数量级,模拟抗体的亲和力至少达到μmol级。结论 构建了以脂运载蛋白为骨架蛋白的核糖体展示模拟抗体库,利用该模拟抗体库成功筛选了四种农兽药残留物的模拟抗体,因为该模拟抗体库本身具有的通用性,理论上可以以任意抗原为靶标筛选其亲和抗体,这就为利用核糖体展示技术从模拟抗体库中筛选多种抗原特别是小分子半抗原的特异性模拟抗体奠定了基础。