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甾醇生物合成中的14α脱甲基酶(CYP51)属于细胞色素P450(Cytochrome P450,简称CYP)家族第五类中唯一的一个家族,与P450其他家族相比,CYP51功能非常保守,作用于移除甾醇前体14α位的甲基,又称为甾醇14α脱甲基酶,具有较强的底物特异性。病原真菌中含有多个CYP51基因,对唑类药剂产生抗性的病原菌中,CYP51基因点突变是病原菌对唑类杀菌剂产生抗性的主要机制。由于唑类杀菌剂中均含有一个含氮杂环,杂环上的氮原子可以与CYP51蛋白血红素-铁活性中心以配位键结合,竞争底物的结合位点,使酶的活性受到抑制。当与唑类杀菌剂结合区域的氨基酸位点发生突变后,使药剂与CYP51蛋白的结合能力下降,引起病原菌的抗药性。稻瘟菌中含有两个CYP51基因,其中MoCYP51A是稻瘟菌分生孢子形成及其致病性所必需的,而且与唑类杀菌剂敏感性相关。为了深入地了解稻瘟菌MoCYP51A在稻瘟菌中参与抗药性的分子机制,作者开展了MoCYP51A表达载体构建及重组MoCYP51A蛋白表达纯化工作,为后续实验其与杀菌剂复合物制备、晶体生长及结构解析工作奠定基础。以稻瘟菌cDNA为模板进行PCR扩增,得到了MoCYP51A全长cDNA片段(1548bp)。构建全长的pHAT2等表达载体进行原核表达,全长蛋白均不表达,与前人研究报道一致。生物信息学分析发现其N端存在跨膜区域,构建去除N端36AA的截断体表达载体,将测序正确的表达载体转化表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。小量诱导实验最终确定IPTG终浓度为0.1 mm、诱导温度为18℃及诱导时间9 h的最佳诱导条件,目标蛋白表达量较高。按照His-tag融合蛋白的亲和纯化方法进行咪唑梯度洗脱目标蛋白,发现目标蛋白主要以包涵体的形式存在,可溶性蛋白含量很少。目前,正在尝试真核表达体系以及包涵体纯化目标蛋白,结合生物信息学分析,在保证蛋白含有结构域行使正常功能的前提下,构建部分截断体表达载体以期获得可溶性蛋白,为后续实验开展奠定基础。