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目的:探讨过继转输父系抗原anergic CD4+T细胞在诱导母-胎免疫耐受中的作用.
方法:建立自然流产小鼠模型CBA♀×DBA/2(♂);以免疫磁珠阴性分选的CBA雌鼠CD4+T细胞为反应细胞,经丝裂霉素C处理的DBA/2雄鼠脾脏细胞作为刺激细胞,加入大鼠抗小鼠CD80/CD86 mAbs共培养,体外诱导针对父系DBA/2小鼠抗原的DBA/2-anergic CD4+T细胞;混合淋巴细胞培养分析鉴定anergic CD4+T细胞对新鲜分离的CBA雌鼠CD4+T细胞的免疫抑制效应及其特异性;以新鲜分离的CBA雌鼠CD4+T细胞为对照,以流式细胞仪和RT-PCR分别分析anergic CD4+T细胞中CD4+CD25+调节性T细胞亚群及其特异性分子标志Foxp3转录水平的变化;建立自然流产模型CBA/J×DBA/2与正常妊娠模型CBA/J×BALB/c.一组于孕第0、2天,另一组于孕第4天将DBA/2-anergic CD4+T细胞过继转输至自然流产模型CBA孕鼠,于孕第14天计算各组宿主孕鼠的胚胎吸收率(n=5).免疫磁珠分选非孕期CBA雌鼠和正常妊娠模型CBA/J孕鼠脾脏细胞中CD4+CD25+T细胞、以及DBA/2-anergic CD4+T细胞中的CD4+CD25+T细胞,并以CFSE标记.于孕第0、2天分别过继转输自然流产模型孕鼠,于转输后48h、96h双光子共聚焦显微镜观察各组CFSE+CD4+CD25+T细胞在宿主孕鼠体内的归巢与分布;FCM分析宿主孕鼠脾脏CFSE+/-T细胞内细胞因子及细胞表面协同刺激分子的表达;ELISA测定母-胎界面组织培养上清中Th1型/Th2型细胞因子表达水平,于孕第14天计算各组宿主孕鼠的胚胎吸收率(n=5).
结果:Anergic CD4+T细胞对新鲜分离的CD4+T细胞具有剂量依赖性和父系抗原特异性免疫抑制效应.Anergic CD4+T细胞中存在Foxp3 mRNA的转录增强和CD25+T细胞亚群的扩增.与未经细胞转输的自然流产模型CBA孕鼠的胚胎吸收率相比,于孕第4天转输DBA/2-anergic CD4+T细胞,未能显著改善自然流产模型宿主孕鼠的妊娠预后(P＞0.05);但于孕第0、2天转输正常妊娠模型孕鼠CD4+T细胞、DBA/2-anergic CD4+T细胞或DBA/2-anergic CD4+CD25+T细胞后,宿主孕鼠的胚胎吸收率均显著下降(P＜0.05);转输C57BL/6-anergic CD4+T细胞或非孕期CBA雌鼠CD4+T细胞后,宿主孕鼠的妊娠预后均无明显改善(P＞0.05).转输正常妊娠模型CBA孕鼠的CD4+CD25+T细胞或DBA/2-anergic CD4+CD25+T细胞,宿主孕鼠的胚胎吸收率分别下降为9.4％(P＜0.05)、9.1％(P＜0.05).转输后48h、96h CFSE示踪的细胞均能归巢分布至宿主孕鼠脾脏、子宫引流淋巴结和母-胎界面.与过继转输非孕期CBA/J雌鼠CD4+CD25+T细胞相比,转输正常妊娠模型CBA/J孕鼠CD4+CD25+T细胞或DBA/2-anergic CD4+CD25+T细胞均能使宿主孕鼠T细胞内IL-2和IFN-γ的表达显著下降(P＜0.01),IL-10的表达显著增加(P＜0.01),但IL-4的表达无显著性变化(P＞0.05).与未经细胞转输的自然流产模型CBA孕鼠相比,转输非孕期CBA/J雌鼠CD4+CD25+T细胞的宿主孕鼠母-胎界面IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β的表达水平无显著性变化(P＞0.05);转输正常妊娠模型CBA/J孕鼠CD4+CD25+T细胞或DBA/2-anergic CD4+CD25+T细胞的宿主孕鼠母-胎界面IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平显著增加(P＜0.05);而IFN-γ和TNF-α的表达则显著下降(P＜0.05).与转输非孕期CBA/J雌鼠CD4+CD25+T细胞相比,转输正常妊娠模型CBA/J孕鼠CD4+CD25+T细胞或DBA/2-anergic CD4+CD25+T细胞,能够下调宿主孕鼠自身T细胞表面CD28的表达,升调节CTLA-4的表达(P＜0.05). 结论：过继转输的DBA/2-anergic CD4+T细胞具有抑制性免疫调节功能,通过"感染性耐受"机制,感染宿主效应性T细胞,使其获得耐受细胞的典型特征,从而诱导宿主效应性T细胞对父系抗原产生特异性免疫耐受,抑制母体对胚胎的免疫排斥,最终改善自然流产模型孕鼠的妊娠预后.CD4+CD25+调节性T细胞在DBA/2-anergic CD4+T细胞诱导的母-胎免疫耐受中发挥必不可少的重要作用.