【摘 要】
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目的:制备Dcbld1基因敲除小鼠,为进一步研究其功能奠定基础。方法:利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠Dcbld1基因。在第四外显子两侧的非编码区各设计两个sgRNA位点,分别将其序列定
【机 构】
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河北省实验动物重点实验室河北医科大学; 河北医科大学生物化学与分子生物学教研室,河北省医学生物技术重点实验室;
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目的:制备Dcbld1基因敲除小鼠,为进一步研究其功能奠定基础。方法:利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠Dcbld1基因。在第四外显子两侧的非编码区各设计两个sgRNA位点,分别将其序列定向克隆至pUC57-sgRNA。两个sgRNA使用线性化的pUC57-sgRNA重组质粒作为模板用MEGAshortscriptTMKit体外转录合成。将制备好的Cas9蛋白和sgRNA进行混合,其浓度分别为Cas9蛋白35 ng/μl,两个sgRNA各5 ng/μl。采用水平显微注射法将其导入560枚C57BL/6×B6D2F1的受精卵雄原核。将注射后存活的约360枚受精卵移植入9只当日见栓的假孕KM雌鼠输卵管中,得到42只子代小鼠,经PCR和测序筛选目标小鼠。结果:共计3只小鼠删除了Dcbld1基因的第4外显子。编辑后的基因产生移码突变,并使翻译提前终止。结论:借助CRISPR/Cas9技术得到了基因敲除小鼠,为研究Dcbld1的作用机制提供了重要的实验条件。
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