【摘 要】
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本文根据猪等孢球虫的18S rRNA基因全序列,运用实时荧光定量PCR建立了猪等孢球虫的LAMP实时荧光检测方法,并对方法中的反应条件进行了优化.结果显示,Bst DNA聚合酶的最佳浓度为8U/25μL; Mg2+、dNTPs、甜菜碱的最佳浓度分别为8 mmol/L、1.6 mmol/L、1 mol/L;内引物的最适浓度为2.0μmol/25μL,内外引物浓度的最佳比值为10∶1.LAMP反应的检
【机 构】
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福建农林大学动物科学学院,福建福州,350002 龙岩学院生命科学学院,福建龙岩,364012
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本文根据猪等孢球虫的18S rRNA基因全序列,运用实时荧光定量PCR建立了猪等孢球虫的LAMP实时荧光检测方法,并对方法中的反应条件进行了优化.结果显示,Bst DNA聚合酶的最佳浓度为8U/25μL; Mg2+、dNTPs、甜菜碱的最佳浓度分别为8 mmol/L、1.6 mmol/L、1 mol/L;内引物的最适浓度为2.0μmol/25μL,内外引物浓度的最佳比值为10∶1.LAMP反应的检测极限是2.74×102 Copies/μL,换算成质粒DNA浓度为1fg/μL,PCR的检测极限为3.37×104 Copies/μL(123fg/μL),LAMP的灵敏度比普通PCR的灵敏度高约1 00倍.在临床中提取特定卵囊个数的DNA进行LAMP和PCR扩增,结果显示,LAMP的检测极限为5个卵囊的DNA,PCR反应为13个卵囊,LAMP的检测极限比PCR高一个数量级.
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通过制备莱克多巴胺-牛血清白蛋白偶联物(Ractopamine-BSA,RAC-BSA)人工抗原,制备并获得高活性单克隆抗体,用辣根过氧化物酶(HRP)标记RAC抗原,以鲁米诺(luminol)为发光底物,建立直接竞争法检测分析莱克多巴胺,并对包被液、包被条件、封闭蛋白、孵育时间、酶用量等参数进行优化,成功研制出化学发光法检测RAC试剂盒.该方法的线性检测范围可达到0.1 ～10.0ng.mL-1
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