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硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD-1)是脂肪组织和肝脏的脂肪代谢中关键的限速酶,催化以棕榈酰辅酶A和硬脂酰辅酶A为主要底物的饱和脂肪酸(SFA)转化为单不饱和脂肪酸(MUFA),对脂肪组织中脂肪酸的组成和脂肪沉积有着重要影响.本研究筛选出调控SCD-1的miRNAs,同时验证了miR181a对SCD-1的调控作用.鉴于SCD-1在脂肪代谢和代谢紊乱疾病中的重要作用,对SCD-1的调控研究为了解猪脂肪代谢的分子机制提供了理论依据.本研究通过生物软件预测靶向SCD-1的microRNA,并从中挑选出miR-1、miR-181a,miR-186做功能分析.构建包含miR-1,miR-181a和miR-186野生型作用位点和突变型作用位点的报告基因载体pGL-1 t,pGL-181 t,pGL-186 t和pGL-1 mt,pGL-181 mt,pGL-186 mt；以NC mimics为阴性对照,将人工合成的ssc-miR-1,ssc-miR-181a和ssc-miR-186与其对应的含靶位点和突变位点载体及pRL-TK质粒共转染至CHO细胞系；用Glo-Dual荧光素酶活性检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性,以pRL-TK表达的海肾荧光素酶活性校正,初步筛选对SCD-1有直接靶向关系的miRNA.将筛选出有效果的miRNA导入猪皮下脂肪前体细胞,同样以NC mimics为阴性对照,观察两组处理的皮下脂肪前体细胞表型差异并对SCD-1及相关脂肪分化基因进行检测.以HepG2细胞为模型,处理后检测SCD-1的蛋白表达水平.结果显示,成功构建包含miR-1,miR-181a和miR-186对SCD-1 3UTR野生型作用位点和突变型作用位点的荧光素酶报告基因载体pGL-1 t,pGL-181 t,pGL186 t和pGL-1 mt,pGL-181 mt,pGL-186 mt；荧光素酶检测结果显示与NC mimics处理组比较,miR-1和miR-186对SCD-1 3UTR的野生型作用位点和突变型作用位点的作用无显著差异,而miR-181a对SCD-1 3UTR野生型作用位点有显著作用(P＜0.01),对突变型作用位点无显著作用；将人工合成的NC mimics和ssc-miR-181a转染至猪皮下脂肪前体细胞后,可观察到miR-181a处理后的细胞,其分化聚酯与对照组有明显差异,脂滴数量较少,分化程度明显低于对照组；检测脂肪代谢相关基因ACC、HSL、ATGL、LPL和PLIN mRNA表达水平,结果显示,ACC、HSL、ATGL、LPL mRNA表达水平,sscmiR-181a处理组较对照组均升高；而PLIN mRNA表达水平,ssc-miR-181a处理组较对照组降低；miR181a序列在人和猪中保守,将人工合成的ssc-miR-181a和NC mimics导入HepG2细胞后用Western blot检测SCD-1的蛋白表达水平,结果显示miR-181a对SCD-1表达有抑制作用.结果提示采用生物软件预测和双荧光素酶报告基因分析系统的构建相结合的方式,验证miR-181a对SCD-1的直接靶向作用,对其蛋白表达水平有明显抑制作用,并对脂肪前体细胞的聚酯分化起到负向调控作用.