依赖核酸序列扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一种以核酸序列中核糖核苷酸(RNA)为模板的等温扩增技术,其特点是反应无需温度循环,不需要特殊的控温仪器。传统的NASBA反应过程由AMV反转录酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶控制,其中的T7 RNA聚合酶由于在高温下易失活,反应体系需要经过高温预处理后再开盖加入酶液,然后在41度下继续扩增1.5-2小时得到检测结果。为了更好的适应基层医疗机构对于病原微生物快速便捷的检测需求,有必要提高NASBA反应温度,缩短检测时间,并实现无需高温预处理的一步法等温扩增。研究发现在NASBA检测体系中引入一种突变型的耐热T7 RNA聚合酶可有效提高反应温度,但是会产生大量的非特异性扩增产物,特别是在含有分子信标的实时扩增体系中,检测信噪比过低,无法有效区分阴阳性扩增结果。本研究利用锁核酸抗核酸酶作用的特性,以肠道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)为研究对象,针对VP1基因设计特异性的检测引物和分子信标,并在分子信标序列中替换不同数量的锁核酸碱基用于NASBA扩增。结果表明,在46度扩增条件下,随着分子信标中锁核酸碱基数由4个增加到8个,检测信噪比从1.6分别增加至3.1和6.2,可在45分钟内完成EV71的一步法等温扩增,检测灵敏度与传统的NASBA扩增结果相当,具有较大的应用前景。