研究背景胶质瘤(Gliomas)是最常见的原发性颅内肿瘤,约占成人恶性肿瘤的2%。2007年至2011年,原发性脑瘤的发病率为每10万人21.4例,胶质瘤发病率为每10万人6.6例,约占颅内肿瘤的45%左右,其中约一半为胶质母细胞瘤(Glioblastomas)。胶质母细胞瘤是一种致命性的疾病,大多数患者在确诊后的15-18个月内死亡,只有不到5%的患者可以存活超过5年。即便是在较为有利的临床试验人群中,5年生存率也不会超过10%。目前,恶性胶质瘤的标准治疗方法是最大安全手术切除、术后放疗,然后辅以替莫唑胺(Temozolomide)的辅助化疗。由于恶性胶质瘤的侵袭性生长特点,很少能完全切除。术中荧光引导技术,如5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA),可以提高切除比例,但不能提高恶性胶质瘤患者的总体生存率。自20世纪50年代以来,对颅内肿瘤患者进行了放射治疗,但该技术发展缓慢,其特点之一是抗放射治疗的胶质瘤干细胞。替莫唑胺是目前治疗恶性胶质瘤最常用的有效的化疗药物,但其结果取决于 O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(O6-methylguaninemethyltransferase,MGMT)的启动子甲基化状态。近年来,随着对胶质瘤生物学特征的认识的增加,越来越多的精确靶向治疗成为了研究的热点。但这些研究目前仍处于起步阶段,且基本未进行相关临床试验,未来仍有很长的一段路需要走。这一切都迫切的催促着人们探究胶质瘤发生发展的分子机制,寻找建立新的治疗靶标。CD300A是CD300家族九位成员之一,是一种60-KD I型跨膜糖蛋白受体,包含胞外IgV样结构域、跨膜结构域和在其胞质尾部的三个经典的ITIM基序。许多研究表明CD300A在髓样和淋巴样细胞中都起抑制作用。在中性粒细胞中,CD300A能够抑制CD32a(FcyRIIa)介导的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生。CD300A 的活化降低了 Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR-9)诱导的促炎介质表达。在人成熟B细胞中,CD300A被发现作为B细胞受体(B-cellreceptor,BCR)介导的信号传导(如Ca2+动员)中的负调节因子,并且降低CD300A水平促进B细胞增殖。有趣的是,在HIV感染的患者中,B细胞中CD300A的表达水平显著低于健康个体,表明CD300A在HIV感染的B细胞异常中的作用。CD300A含有的胞质区域内的共有的免疫受体酪氨酸抑制基序抑制了 FcεRI介导的信号传导和体外人和小鼠MCs的脱粒。另外,CD300A通过Toll样受体4抑制信号传导并抑制MCs和巨噬细胞体外生产细胞因子和趋化因子。与野生型(Wird type,WT)小鼠相比,CD300A-/-小鼠显示出腹腔细菌清除率提高,CLP术后存活时间延长。类似地,MC缺陷Kitw-sh/W-sh小鼠腹腔注射CD300A-/-的骨髓来源的培养的MCS(BMMCS),相比于腹腔注射WTBMMCS的小鼠,表现出很大改善的细菌清除率和CLP后存活率。表明MCs上的CD300A涉及细菌清除率和存活。人们对CD300A的各方面都知之甚少。虽然明确它属于一组抑制性免疫受体,在髓系和淋巴谱系细胞表面都有差异表达,但有关其在细胞分化、抗原呈递、细胞因子产生、细胞介导的细胞毒性、免疫突触终止等关键免疫功能中的作用尚不可知。CD300A介导的信号转导也是一个非常复杂的过程,涉及许多的参与者。目前仍需要更多的研究来确定参与CD300A信号转导途径的磷酸酶的靶点和独特的下游信号转导成员。研究发现CD300A参与某些人类疾病的发生发展,包括癌症、病毒感染、败血症、自身免疫疾病、炎症和过敏性疾病。但我们在理解CD300A在疾病中的作用及其作为治疗目标的潜力方面仍处于起点。最新的研究表明,CD300A参与血液恶性肿瘤的发展。与正常CD19+CD10+B细胞祖细胞相比,CD300A与其他标记物一起在急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)中差异表达。CD300A表达水平更高的患者总体存活时间较短,无复发,提示CD300A可以作为ALL患者临床分级的一种生物标志物。此外,小鼠遗传学研究表明,CD300A通过招募SHP-1和SHIP-1校准致癌信号强度,表明CD300A的靶向可能是治疗ALL的一种策略。虽然CD300A在实体肿瘤中是否发挥作用仍不清楚,但是最近的一项研究表明,CD300A与PS的相互作用抑制了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。并有多项研究表明,在肿瘤微环境中,酸性、活性氧和短暂缺氧对肿瘤内皮细胞有明显的胁迫作用,导致PS的再分布和暴露。事实上,在胃癌,卵巢癌和黑素瘤中都检测到了 PS的表达。最新研究表明,Mn细胞暴露在缺氧状态可导致细胞内CD300A转录物的增加,其可在3小时内检测到,并且通过再氧合作用抵消。其恢复到常氧细胞的表达水平与HIF-la的积累相关。在髓细胞前体和MDM中也观察到了响应缺氧的CD300A转录物的增加。并且CD300A的激活调节了 Mn细胞中VEGF和CCL20的表达。另外有研究表明CD300A参与了人类Mn细胞中IL-8和MMP9的表达调节。缺氧是绝大多数实体瘤中普遍存在的现象,并与肿瘤的进展和转移密切相关。VEGF的表达与肿瘤内血管形成和血管密度分布有关,还可以刺激内皮细胞的存活,增殖和迁移;MMP-9涉及肿瘤细胞的迁移过程。这些结果侧面表现了 CD300A与实体瘤的发生和发展存在的联系。目的本课题旨在探讨CD300A在人类脑胶质瘤进展中的作用及机制。方法利用基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)中163例多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)样本和相应的207例癌旁组织,以及518例低级别胶质瘤(Lower grade glioma,LGG)样本和相应207例癌旁组织的基因表达数据,分析CD300A mRNA在胶质瘤中的表达变化,并探究CD300A在胶质瘤中的差异表达具有的生物学意义,例如与患者预后的相关性。收集临床胶质瘤组织及正常脑组织样本,通过实时定量PCR、western blot以及免疫组织化学等实验方法检测,CD300A在临床胶质瘤组织及正常脑组织样本中的表达模式。选用胶质瘤细胞系U87和U251作为体外研究细胞模型,通过转染siRNA-CD300A,构建CD300A敲低(siCD300A)细胞株。利用CCK8实验检测CD300A敲低对细胞增殖的影响。使用Transwell实验探究CD300A表达下调对细胞迁移的影响。通过流式细胞术检测CD300A敲低对细胞凋亡的影响,并通过western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化。最后,深入探究CD300A在胶质瘤细胞中发挥作用所涉及的信号途径。结果GEPIA分析结果表明CD300AmRNA在胶质瘤中表达显著上调(P<0.05),并与胶质瘤患者的总生存率呈负相关(P<0.001)。CD300A高表达预示预后不良。临床样本分析结果表明,与正常脑组织样本相比,CD300A在多形性胶质母细胞瘤组织中的mRNA及蛋白表达显著上调(P<0.05)。细胞实验结果表明,CD300A的敲低显著抑制了 U87和U251细胞的增殖能力(P<0.05)。并且,CD300A敲低的U87细胞的迁移细胞数降低至约1/2(P<0.05)。此外,CD300A敲低的U87细胞的凋亡率由23.22 ±2.14%明显增多至55.8±6.73%(P<0.01)。CD300A通过调控凋亡相关蛋白的表达诱导细胞凋亡,包括上调促凋亡蛋白caspase3和Bax的表达。机制研究结果表明,CD300A的敲低抑制了 AKT的磷酸化,和AKT信号途径关键下游蛋白P70的表达。结论及意义本研究发现CD300A通过AKT信号途径在胶质瘤进展中发挥促癌作用,在未来可能成为胶质瘤治疗的潜在靶标。