弓形虫热休克蛋白(Hsp90)作为一种伴侣蛋白分子,参与多种细胞信号转导通路,为探索其生物学功能,本研究构建弓形虫Hsp90基因敲除转染质粒(Hsp90-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript)及过表达质粒(SAG1-Hsp90-pTCY),为后续实验奠定基础。根据ToxoDB数据库中公布的TgHsp90基因序列,设计并合成三对特异性引物,利用PCR技术特异扩增TgHsp90基因的5’非翻译区(5’UTR)、3’非翻译区(3’UTR)、Hsp90编码区(Hsp90-CDS),将其分别亚克隆入pMD-18T载体中。将重组质粒5’、3’/UTR/TA亚克隆入转染质粒pBLE-pBluescript中,构建敲除质粒Hsp90-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript:将重组质粒Hsp90-CDS/TA亚克隆入转染质粒pTCY(SAG1-CAT-YFP)中,构建过表达质粒Hsp90-pTCY。经DNA测序分析,成功获得Hsp90 5’UTR、3’UTR片段,大小为1 796bp、1 773bp;Hsp90-CDS片段经DNA测序分析,成功获得该片段,大小为2127bp;重组质粒Hsp90 3’UTR/TA、Hsp90-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript、SAG1-Hsp90-pTCY经HindⅢKpnⅠ、NotⅠ和SpeⅠ、HindⅢEcoRⅠ双酶切鉴定,得到大小约为1700bp、1700bp、2100bp左右的目的条带,酶切鉴定结果均与预期结果相符;以上实验结果显示成功构建了弓形虫Hsp90敲除质粒及过表达质粒,为研究Hsp90基因特性提供基础。