【摘 要】
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目的 构建葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal endotoxin A,SEA)和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-Associated Antigen A3,MAGE-A3)基因共表达的真核表达载体,检测、鉴定其在293T细胞中的表达.方法 分别用RT-PCR方法及人工化学合成法获得MAGE-A3和SEA基因片段,然后依次将MAGE-A3和SEA基因克隆至含内部核糖体进入位
【机 构】
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广州市第一人民医院耳鼻咽喉科 广州医学院实验医学研究中心
【出 处】
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广东省医学会第十六次耳鼻咽喉学学术会议
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目的 构建葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal endotoxin A,SEA)和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-Associated Antigen A3,MAGE-A3)基因共表达的真核表达载体,检测、鉴定其在293T细胞中的表达.方法 分别用RT-PCR方法及人工化学合成法获得MAGE-A3和SEA基因片段,然后依次将MAGE-A3和SEA基因克隆至含内部核糖体进入位点的真核表达载体IRES序列的上、下游,构建成重组质粒pAGEA3-IRES-SEA.经脂质体转染至293T细胞以后,用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别鉴定SEA、MAGE-A3基因的表达.结果 限制性内切酶酶切分析证实MAGE-A3基因和SEA基因均正确地克隆在pMAGEA3-IRES-SEA中,基因测序结果与GenBank公布的MAGE-A3、SEA序列完全一致,实现了双基因的正确重组.重组质粒转染293T细胞后能检测到MAGE-A3、SEA基因的高水平的有效表达.稳定表达双基因的293T细胞上清对PBMC增殖有促进作用,与细胞中SEA的表达和分泌有关.结论 成功地构建了pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3和SEA蛋白,由此奠定了其作为抗喉癌DNA疫苗应用的基础.
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