【摘 要】
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为了对蓝氏贾第虫贾第素α-18(alpha-18 giardin,AG-18)基因进行原核表达及融合蛋白的纯化,以便进一步对其亚细胞定位和致病机制进行研究.根据GenBank上AG-18基因序列,设
【机 构】
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华南农业大学兽医学院,广州 510642
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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为了对蓝氏贾第虫贾第素α-18(alpha-18 giardin,AG-18)基因进行原核表达及融合蛋白的纯化,以便进一步对其亚细胞定位和致病机制进行研究.根据GenBank上AG-18基因序列,设计特异性引物,以A型贾第虫基因组DNA为模板,应用PCR扩增AG-18编码基因；将PCR产物连接到pMD-18T载体,构建pMD-AG-18克隆质粒；经PCR鉴定及测序后,采用BanHⅠ和XhoⅠ对质粒进行双酶切,将回收的AG-18基因片段连接到表达质粒pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-AG-18；经双酶切和测序鉴定后,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Westem blot分析,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化AG-18融合蛋白.结果显示AG-18基因扩增片段大小为861 bp,与预期相符；重组表达质粒pET-AG-18经双酶切后,在琼脂糖凝胶电泳上861bp和5369bp处出现2条明显的条带；经IPTG诱导后,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,SDS-PAGE及Western blot分析显示在相对分子质量为35.8kDa处出现目的蛋白条带,与理论值相符；纯化后可溶性蛋白浓度为1.18mg/mL.结果表明蓝氏贾第虫贾第素α-18基因原核表达载体pET-AG-18构建成功,目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达,并且获得了大量纯化的AG-18融合蛋白,为AG-18多克隆抗体的制备及其在贾第虫滋养体的亚细胞定位等研究奠定了基础.
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