Tet off诱导k562细胞表达SATB1稳定细胞系的建立

来源 :广东省医学会第十七次血液病学学术会议 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zoeshuwen88
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  目的:建立Tet off诱导表达SATB1的白血病稳定细胞系,为研究SATB1基因在白血病发病中的生物学功能和机制奠定基础。方法:采用Real-time PCR和Western Blot的方法检测SATB1基因在白血病细胞株中的表达情况,选取SATB1低表达的k562细胞作为建模细胞;设计引物,采用RT-PCR的方法在人正常细胞中扩增SATB1基因全长,酶切后连接pRetro-tight-puro逆转录病毒载体,通过酶切和测序鉴定SATB1基因序列正确;采用钙转的方法将pRetro-tight-advance与包装质粒共同转入293FT细胞,收集上清病毒,感染k562细胞,G418筛选14天后,挑取若干细胞单克隆进行扩增培养;将pRetro-tight-luc和包装质粒共同转染进293FT细胞,收集上清病毒,感染进pRetro-tight-advance k562单克隆细胞株,扩增培养后,采用荧光素酶报告基因检测系统检测强力霉素(DOX)对单克隆细胞株的诱导表达情况,挑选出一株荧光素酶表达高,加入强力霉素(DOX)后背景底的细胞株作为工具细胞;继而包装pRetro-tight-SATB1逆转录病毒感染该细胞株,采用嘌呤霉素筛选细胞2天,挑取若干细胞单克隆扩增培养,采用Real-time PCR和Western Blot的方法检测强力霉素(DOX)对各个单克隆SATB1诱导表达的情况,挑选出SATB1表达高,背景底的单克隆,建立SATB1稳定表达的细胞系。结果:通过荧光素酶报告基因检测系统筛选出了一株荧光素酶表达高,加入强力霉素(DOX)后背景底的理想细胞株,用SATB1逆转录病毒感染该细胞后采用Real-time PCR和Western Blot的方法筛选出了一株SATB1稳定高表达,背景低的细胞系。结论:在K562白血病细胞株中,成功建立了Tet off诱导表达SATB1稳定细胞系,为下一步进行该基因在白血病发病中的功能研究和机制探讨奠定了基础。
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