本研究拟构建新孢子虫ROP5缺失株(ΔNcROP5)和ROP16缺失株(ΔNcROP16),通过与标准株Nc1株比较,观察新孢子虫ΔNcROP5和ΔNcROP16虫株的生物学特性变化,探索新孢子虫ROP5和ROP16的功能。首先在ToxoDB上查询获得NcROP5的基因组序列,据此设计构建NcROP5敲除质粒pΔNcROP5,通过基因扩增、酶切分析和测序比对,确定质粒pΔNcROP5构建成功,以相同的方法获得NcROP16敲除质粒pΔNcROP16,分别将构建成功的质粒pΔNcROP5、pΔNcROP16电转新孢子虫Nc1株。经过荧光标记和连续给药筛选,当虫体发光率达到80％左右时进行单克隆筛选,分别设计不同的NcROP5、NcROP16基因检测引物和重组基因检测引物,通过PCR初步鉴定为NcROP5或NcROP16基因缺失的阳性单克隆株进行增殖后,再进行转录水平和蛋白水平鉴定,对多种方法鉴定的缺失虫株进行连续传代,最终获得稳定传代的新孢子虫ROP5缺失株(ΔNcROP5)和ROP16缺失株(ΔNcROP16)。分别对ΔNcROP5虫株、ΔNcROP16虫株与新孢子虫标准株Nc1株比较研究,发现ΔNcROP5虫株的胞内增殖与Nc1株相比差异不显著,即NcROP5的缺失不影响新孢子虫Nc1株在胞内增殖,但是NcROP16的缺失显著减缓了新孢子虫Nc1株在胞内的增殖速度；相对荧光定量检测ΔNcROP5和ΔNcROP16虫株中的ROP2家族其他基因(ROP5、ROP7、ROP16、ROP17)和致密颗粒蛋白编码基因(GRA6、GRA7)等基因的转录水平,与Nc1株相比,ΔNcROP5虫株中以上基因的转录水平均无显著差异；而ΔNcROP16虫株与Nc1株相比,其ROP7、ROP17和GRA7基因的转录水平均显著升高。动物接种试验,发现ΔNcROP5虫株与Nc1株的毒力无明显差异。以上结果提示NcROP5可能并非新孢子虫的关键毒力因子,而NcROP16可能与新孢子虫胞内增殖密切相关。