引言/目的牛冠状病毒（BCoV）是引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原,主要通过消化道和呼吸道传播,感染的牛长期带毒并在一定时期内持续排毒,易造成牛群的大范围感染。因此,对带毒牛的及时检出和牛场环境监测就显得尤为重要。因此,本研究建立了SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法并初步应用于临床样本的检测,为BCoV的临床诊断提供了技术保障。材料与方法根据BCoV Mebus株N基因的保守区,合成、筛选出最佳引物对。以BCoV的cDNA为模板进行PCR扩增,克隆、测序,获得质粒标准品。以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度检测。以牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒等病毒的cDNA/DNA为模板,进行特异性检测:以7.8×10³⁶copies/μL进行重复检测。结果与讨论采用最大二阶导数法绘制标准曲线,回归线误差值为0.0742,扩增效率为1.663。通过对溶解曲线分析,发现BCoV样品为单峰,而阴性对照及其它病毒没有出现熔点峰,表明该方法特异性好。SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法最低检出限为7.8拷贝/μL,而RT-PCR为7.8×10²拷贝/μL,具有较高的灵敏性。通过对39份腹泻样本检测,本方法检测出BCoV阳性20份,阳性率为51.28%,而RT-PCR仅检出阳性16份,阳性率为41.03%。目前,BCoV的核酸检测主要有RT-PCR、巢式PCR、TaqMan荧光定量RT-PCR方法方法。RT-PCR、巢式PCR灵敏度较低,而TaqMan荧光定量RT-PCR方法存在探针设计复杂、淬灭不彻底、成本高等不足。本方法以价格低廉的SYBRGreenⅠ染料代替探针,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可以用于牛冠状病毒病的实验室早期诊断。结论本研究建立的牛冠状病毒SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法特异、敏感、高效,且每次反应可同时进行96个样本的检测,可对大规模爆发的疫情做出快速、准确的诊断。