花狭口蛙海南亚种皮肤溶血素的分离纯化及细胞凋亡诱导活性

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两栖类动物皮肤担负着许多生理功能,如呼吸、水份调控、温度控制、排泄、繁殖、抵抗微生物、防御天敌等,是其得以生存的重要器官。存在于两栖动物皮肤分泌物中的生物活性成分已成为研究热点,目前已分离鉴定出许多具有各种生物活性的蛋白及多肽。从花狭口蛙海南亚种(Kaloulapulchra hainana)皮肤分泌物中分离纯化出溶血活性蛋白,该蛋白为单链蛋白,分子量为22 kDa,将其命名为Kp-hemolysin。利用人,牛,兔,和鸡的红细胞检测了Kp-hemolysin的溶血活性,其中人红细胞最敏感。在渗透保护剂聚乙二醇(PEG 300,400,1000,3400,6000Da)和糖类(N-乙酰半乳糖,吡喃甘露糖苷,葡萄糖,海藻糖,乳糖),金属离子(Mg2+,Ca2+,Ba2+,Cu2+,K+),抗氧化剂(抗坏血酸,还原型谷胱苷肽,半胱氨酸)等存在下,分析了不同因素对Kp-hemolysin溶血活性的影响。结果显示PEG300对其溶血活性无影响,而PEG400(分子直径1.36 nm)有一定影响,PEG1000(分子直径2.0 nm)及以上则显著抑制Kp-hemolysin的溶血活性,小分子糖类则对其溶血活性无影响。抗氧化剂及金属离子对其溶血活性几乎无抑制作用。由此推断,Kp-hemolysin的溶血活性是由于其在细胞膜上附着聚集形成孔道而引起细胞破裂溶解,孔道直径约为1.36 nm和2.0 nm,而不是由于对红细胞膜的氧化性损伤造成。通过:MTT法检测,Kp-hemolysin对人乳腺癌细胞MCF-7,人胃癌细胞AGS具有细胞毒活性,作用24 h后,其CC50(ytotoxic concentrations)分别为0.92,1.21□M。经DNA片段化,细胞核形态变化及流式细胞仪分析,结果显示,Kp-hemolysin具有诱导上述肿瘤细胞凋亡的特性。但其诱导细胞凋亡的机制还有待于进一步研究。
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