目的由于抗生素的滥用和细菌的进化,临床上耐药细菌感染问题愈发严重。我们针对目前临床感染率高、治疗最为困难的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),合成了54个新型结构的4-羟基香豆素类化合物,并优选出了抗菌效果明显的目标化合物,并对该类化合物的抗菌机制及靶标进行了深入研究。方法在体外培养的MRSA标准菌株和临床菌株,评价了4-羟基香豆素类化合物的抗菌活性和耐药性;在MRSA制备的小鼠脓毒血症模型,观察了化合物对模型动物生存率、重要脏器细菌菌落数(CFU)和病理学改变的影响;利用透射电镜观察了化合物对MRSA的作用部位;通过蛋白质组学技术分析了其可能的抗菌靶点;纯化靶蛋白,高通量SPRi技术进一步检测了目标蛋白与小分子化合物之间的相互作用;RT-PCR研究了化合物对MRSA毒力因子和生物膜相关因子表达的影响。结果在多株MRSA标准菌株和临床菌株,药敏试验结果显示其中3个化合物具有显著杀菌作用(最小抑菌浓度达1μg/ml),细菌生长曲线呈药物浓度依赖性;梯度浓度目标化合物对MRSA连续处理4周,化合物对MRSA菌株的MIC值未见改变,提示细菌对该类化合物不容易产生耐药性。在USA300 MRSA诱导的小鼠脓血血症模型,目标化合物可明显提高小鼠生存率,显著降低小鼠血液、肝脏和肺脏内耐药细菌CFU,改善模型动物肝脏、肺脏等脏器的炎症损伤。MRSA拟核区致密物质在化合物处理后发生明显变化,提示化合物主要通过细菌内机制发挥抗菌作用。蛋白质组学结果显示目标化合物导致244个蛋白表达差异,在表达下调的蛋白中,差异倍数最大的前五位蛋白依次是鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酸脱亚胺酶、免疫球蛋白G结合蛋白A、甘氨酸分裂系统蛋白H、氨基甲酸激酶。通路分析显示鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酸脱亚胺酶和氨基甲酸激酶是MRSA精氨酸代谢通路的关键酶,提示化合物可能的靶标为精氨酸抑制蛋白(Arg R)。纯化Arg R蛋白后,高通量SPRi检测到化合物配体与Arg R结合信号明显,且随着Arg R浓度的增大结合信号变强,互作用亲和力常数在10-8~10-7之间。目标化合物可显著降低MRSAhla、pvl、psmα、psmβ、alt E、aap、ica等毒力因子和生物膜形成相关因子m RNA的表达。结论通过体内外抗菌实验,优选出了对MRSA具有较高活性的目标化合物。进一步研究发现其抗菌机制可能通过与细菌Arg R结合,抑制精氨酸代谢通路关键酶(鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酸脱亚胺酶和氨基甲酸激酶)的合成,最终抑制毒力因子和生物膜形成相关因子m RNA的表达、细菌蛋白质的合成,从而发挥其抗菌作用。本研究为研制抗多重耐药细菌新型化学结构药物奠定了基础,同时也探索了治疗细菌耐药可能的新靶标。