应用RACE技术体外扩增HCMV UL148基因全长cDNA

来源 :广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sheep1230_yuzt1984
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  目的 通过RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术获取HCMV-Towne病毒株的UL148基因相关转录本cDNA序列。方法 将HCMV-Towne病毒株接种至生长良好的HFF细胞,待细胞出现病变后,取上清液,提取病毒DNA;应用多重PCR技术鉴定HCMV病毒;收集病变细胞,抽提病毒RNA;根据已知的部分cDNA序列,分别在其5和3端设计特异性引物,与5RACE和3RACE接头引物相对应,扩增HCMV-Towne病毒株UL148基因的5和3末端。应用pMD-T载体作TA克隆,构建5和3RACE产物的重组体;对重组体进行测序鉴定;根据5,RACE和3RACE结果设计引物;应用RT-PCR技术扩增UL148基因的全长cDNA序列,与GenBank上已知Towne病毒株的序列进行比较。结果 HCMV感染成功,抽提病毒RNA后,采用5和3RACE技术,成功扩增出UL148基因的5和3末端;测序结果表明其5末端长496bp,3末端长995bp;RT-PCR技术扩增UL148基因全长cDNA序列,全长共2442bp,UL148基因和UL132基因共同转录,共用的3末端包括11个腺苷酸的poly A尾,位于加尾信号下游区域20bp左右;结论 应用RACE技术成功获得HCMV病毒株UL148基因和UL132基因的全长cDNA序列,全长共2442bp;从结果推测,UL148基因和UL132基因可能是一个转录本,共用3末端。
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