【摘 要】
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细胞表面展示脂肪酶与游离酶相比,具备耐有机溶剂以及更高的温度稳定性等优点,有望成为固定化酶的可替代技术之一.展示酶依赖于锚定蛋白与细胞壁相连接,因而展示效率与细胞壁结构密切相关.酵母细胞壁最外层为甘露糖蛋白层,决定细胞免疫识别等功能,与之相邻一层是β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖形成的交联网状结构,GPI-anchor、Pir、FS、GCW61等([)锚定蛋白结合在β-1,3-葡聚糖和β-1
【机 构】
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华南理工大学生物科学与工程学院,广东省发酵与酶工程重点实验室,广东广州510006
【出 处】
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2016第五届中国食品安全高峰论坛
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细胞表面展示脂肪酶与游离酶相比,具备耐有机溶剂以及更高的温度稳定性等优点,有望成为固定化酶的可替代技术之一.展示酶依赖于锚定蛋白与细胞壁相连接,因而展示效率与细胞壁结构密切相关.酵母细胞壁最外层为甘露糖蛋白层,决定细胞免疫识别等功能,与之相邻一层是β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖形成的交联网状结构,GPI-anchor、Pir、FS、GCW61等([)锚定蛋白结合在β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖糖链上.α-1,2-甘露糖转移酶Mnn2参与细胞壁中甘露糖糖链的加工和延伸.其缺失与过表达可能会对细胞壁的结构产生影响,进而影响细胞壁上的锚定蛋白数量以及展示酶的活性和展示酶量.本研究以表面展示脂肪酶Candida antarctica lipase B(CalB)的毕赤酵母重组工程菌为出发菌株,构建了Mnn2基因缺失菌GS 115/Gcw61-CalB-△Mnn2以及Mnn2过表达重组菌GS 115/Gcw61-CalB-Mnn2.敲除菌和过表达重组菌经250 mL摇瓶发酵,均与出发菌株生长能力相似.摇瓶发酵72 h,Mnn2敲除菌株表面展示的脂肪酶活力比出发菌株提高了17.6％,比过表达菌株提高36.4％,敲除菌的展示酶活最高达1800 U/g.RT-PCR检测表明,CalB基因在缺失、对照和过表达Mnn2基因的酵母表面展示重组菌株中转录水平相同,排除了基因拷贝数不同引起展示酶活力不同的可能性.流式细胞仪检测发现,菌株荧光量大小顺序为：敲除菌株＞对照菌株＞过表达菌株,表明表面展示脂肪酶展示量的增加.CW、CR和SDS细胞壁干扰剂平板耐受性实验表明α-1,2-甘露糖转移酶过表达,会引起细胞壁增厚,甘露糖增加；而缺失菌株则出现了甘露糖减少,几丁质增加的情况,说明Mnn2基因敲除和过表达可以对细胞壁的组成和结构产生影响,结合敲除菌、过表达菌的展示脂肪酶活力表现,可初步说明α-1,2-甘露糖转移酶Mnn2的缺失有助于提高酵母表面展示脂肪酶的效率.
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