【背景】猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）和猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）是当前导致猪群发生病毒性腹泻的四种主要病原，并且常发生混合感染。【目的】建立一种可鉴别诊断这四种腹泻病毒病的检测方法，这对于临床诊断具有重要意义。【方法】针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物，进而构建相应的重组质粒标准品。通过对PCR反应条件优化，建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法。随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证。【结果】敏感性试验结果显示，对PEDV-M、TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×102 copies/μL、1.5×103 copies/μL、1.6×102 copies/μL和1.6×102 copies/μL；特异性试验结果显示仅可检出本研究中的四种靶病毒，而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出。重复性试验结果显示，选取108、106和104 copies/μL三个不同浓度的重组质粒作为模板，其他条件不变，分别进行5次重复试验，5次试验均扩增出清晰、均匀的条带。对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测，发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37％（19份）、6％（3份）、10％（5份）和25％（13份）。其中PEDV和PoRV混合感染2份（4％），PEDV和TGEV混合感染2份（4％），PEDV和PDCoV混合感染1份（2％）。通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证，结果显示多重RT-PCR与常规单重PCR结果符合率为100％。最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证，结果均为相应病毒的基因片段。【结论】本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法，研究结果为临床四种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段。