辣椒炭疽病菌是制约辣椒生产的重要真菌,主要侵染辣椒果实和茎叶,影响辣椒的品质和产量。辣椒炭疽病菌种类较多、种群遗传多样性复杂,田间复合侵染频发,抗性品种抗性丧失,导致辣椒炭疽病的防控相对困难。为此,深入解析炭疽病菌与辣椒的互作与识别机制,针对性挖掘靶向性抗性资源,成为辣椒炭疽病有效防控研究热点。前人研究证实保守的真菌效应蛋白Nis1（Necrosis-inducing secreted protein 1）可通过靶向植物免疫激酶抑制病原物相关分子模式触发的免疫（PAMP-triggered Immunity,PTI）,我们前期克隆证实辣椒炭疽病菌NIS1基因存在多态性,但是在辣椒炭疽病菌中的具体功能差异没有相关报道。为此,我们以辣椒胶孢炭疽病菌CSLL11的NIS1为研究对象,探讨对病原菌生长发育和致病性的影响,为辣椒炭疽病的化学防治及抗病育种提供新的靶标和思路。具体研究结果如下:1.克隆了22株辣椒炭疽菌的NIS1基因,成功建立了一种NIS1-PCR-RFLP的标记系统,可快速有效区分侵染辣椒的Colletotrichum truncatum,C.capsici,C.brevisporum,C.gloeosporioides和C.acutatum,其区分效果明显优于rDNA-ITS标记系统,具有特异性强,简便直观等特点,是炭疽病菌区分新的分子标记。2.成功构建了潮霉素标记的pCX62::ΔCgNis1敲除载体,利用PEG介导的原生质体转化法,敲除了辣椒胶孢炭疽NIS1基因获得突变体菌株47个,PCR验证阳性转化率为65.96%,Southern杂交证实成功敲除了目的基因NIS1。3.成功构建了G418标记的pGTN::ΔCgnis1/CgNIS1回补载体。以突变体菌株ΔCgnis1-3为目标菌株,利用PEG介导的原生质体转化法,获得回补菌株48个,PCR验证回补阳性转化率77.08%,目的基因NIS1回补成功。4.生物学表型分析表明:与野生型比较,突变体ΔCgnis1-3和ΔCgnis1-12菌丝生长速率平均下降8.42%,菌丝极性生长受阻,尖端钝化并伴随畸形生长,产孢量显著降低36.10%,但是分生孢子形态没有变化,对过氧化氢的耐受力下降9.85%;致病力明显低于野生型菌株,细胞质膜完整性受损,而回补菌株相关生物学表型得到恢复,与野生型一致。5.克隆了辣椒胶孢炭疽病菌CSLL11的CgNIS1基因,构建植物亚细胞定位分析载体pBin:CgNIS1:e GFP,利用农杆菌GV3101在本氏烟叶片中进行瞬时表达,结果证实该基因定位在细胞核和细胞质膜,同时发现伴随寄主细胞坏死的现象。6.成功建立了辣椒尖孢炭疽遗传转化体系。采用PEG介导的原生质体转化法成功地将抗性标记基因和e GFP导入尖孢炭疽基因组。结果表明,分生孢子萌发后8～12 hrs和细胞壁裂解时间2 hrs为原生质体最佳制备体系,转化子的潮霉素筛选浓度为400 mg/L,G418筛选浓度为500 mg/L,转化子继代培养3代,荧光显微镜观察荧光信号未发生减弱。