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肠出血性大肠杆菌(EHEC)属于埃希菌属大肠埃希菌种，能引起人出血性肠炎(HC)，严重者可致出血性尿毒综合征(HUS)。在已经确定的EHEC的诸多血清型中，O157：H7和O157：H-是最重要的致病血清型。2000年在河南省某县发生该省首次大肠杆菌O157：H7感染性腹泻疫情。从3月17日到7月6日，共发生病人35例，合并急性肾功能衰竭32例，死亡28例，肾衰病死率87.5％。有关疾病预防控制部门对此次疫情进行了调查，发现疫区家禽家畜广泛携带O157：H7大肠杆菌，并高度怀疑家禽家畜是此次疫情的主要传染源。因此本研究即运用细胞培养、多重PCR以及脉冲场凝胶电泳和16S rDNA探针Southern杂交等方法，对来自疫区不同家禽家畜的20株大肠杆菌O157：H7菌株进行了毒性测定、毒力基因(stx1、stx2、eae)检测，比较了不同动物宿主来源菌株的致病性，并确定了它们相互之间的遗传关系。 方法 1 Vero细胞毒性检测：每一株O157：H7均挑取单菌落，接种5 ml LB液体培养基，37℃振荡过夜培养。取1 ml菌液，分别采用多粘菌素裂解法和直接离心法提取毒素，并同时设立阴性对照为同法制备的无菌LB液体培养基和不加多粘菌素的无菌纯水。向96孔平底细胞培养板上的1天龄单层Vero细胞中分别加入两种方法制备的毒素提取液，每一毒素提取液分别加入两个不同稀释比，将培养板放入5％二氧化碳培养箱，37℃培养，每12小时在倒置显微镜下观察一次，共持续48小时，以75％细胞出现细胞病变郑州大学硕士学位论文河南唯县动物大肠杆菌0 157:H7菌株的毒性检测与遗传关系分析为终点，在倒置显微镜下照相记录结果。 2多重PCR(MultiPlex PCR)检测毒力基因:按照引物设计的常用原则，在线进行了所用多重PCR引物的设计，并确定所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单独的反应中得到有效的扩增，煮沸法制备模板DNA，PCR扩增stxl、:txZ、。a。基因，并进行水平电泳，照相记录结果。 3快速PFGE一RFLP:参考有关方案，将细菌包埋在琼脂糖栓中，原位裂解并洗涤，用 Xbal原位酶切染色体，然后进行CHEF脉冲场凝胶电泳，电泳终止后，取出凝胶，用1 ug/ml澳化乙锭显色，观察并记录结果。 416srDNA基因探针southern杂交:以pKK3535质粒为模板，自行设计引物，扩增一段保守的165 rDNA基因序列，并在PCR扩增时掺入地高辛标记的dUTP，从而使探针带上地高辛标记。将脉冲场电泳后的凝胶经脱嗦吟、变性处理后，用虹吸法把DNA转印到尼龙膜上，80℃干烤2小时加以固定。将尼龙膜预杂交及与探针杂交后，显色并照相记录结果。结果 1菌株毒性检测结果:Vero细胞毒性实验和多重PCR实验一致显示20株大肠杆菌0157:H7中有n株毒素阳性，均携带stxZ基因和eae基因，其中有10株分离自波尔山羊，另一株分离自鸡，其余分离自牛、猪、山羊和鸡的9株0157:H7毒性检测阴性。 2快速PFGE一RFLP结果:20株0157:H7菌株一共呈现出n种电泳型别，其中毒性检测阳性菌株共有5种电泳型，毒性检测阴性菌株共有6种电泳型。 3 16SrDNA基因探针标记产物鉴定:加有DIG刁UTP的标记管和未加DIG一dUTP的对照管PCR产物，经电泳后，标记管产物电泳条带位置稍落后于大小为698bp的对照管产物电泳条带，这说明165 rDNA基因探针标记成功。 4 16SrDNA基因探针Southern杂交结果:20株0157:H7菌株一共呈现出11种杂交型别，其中毒性检测阳性菌株有5种杂交型，毒性检测阴性菌株有6种杂交型。 5数值分析:对电泳图谱和165 rDNA指纹图谱进行数值编码，运用一一一一---------~..一一1SAS统计软件（VS）对数据进行聚类分析和主成分分析。数值分析揭示毒素阳性菌株之间遗传关系比较密切，而毒素阴性菌株之间在遗传上则相对疏远，并提示在家禽家畜之间存在广泛的大肠杆菌O157卫7的相互传播，另外分析发现三个有遗传意义的统计指标和与遗传关系密切相关的电泳条带。 结 论 1波尔山羊很有可能就是这次疫情的主要传染源。但应该进一步研究非典型的已知毒素阴性菌株的流行病学意义。 2 20株大肠杆菌O157E7中毒素阳性株表现出较为紧密的遗传关系，而毒素阴性株之间的遗传关系则相对比较疏远。 3 家禽家畜之间存在着广泛的大肠杆菌O157D7的相互传播。 4初步建立了基于 PFGE－RFLP和 165 rDNA指纹图谱方法的大肠杆菌O157“7分子分型体系，首次提出区分大肠杆菌O157K7毒素阳性株和毒素阴性株的统计指标，并指出大肠杆菌O157E7在Xbal酶切的脉冲场凝胶电泳和电泳后的 16s rDNA指纹图谱中的有重要遗传意义的主要条带。