论文部分内容阅读
心搏骤停(CA)/心肺复苏(CPR)后脑损伤是复苏后死亡的主要原因,低温治疗对复苏后脑损伤有明确的保护作用,但具体机制不明。核因子相关因子2(Nrf2)是重要的内源性抗氧化因子,有研究发现Nrf2可能参与低温对复苏后脑保护。最近研究发现除了Kelch样氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)外,丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/糖原合成激酶-3β(GSK-3β)通路负向调控Nrf2表达,但Akt/GSK-3β/Nrf2通路是否参与了低温对复苏后脑损伤的保护,目前尚未有文献报道。为阐明Nrf2与低温对复苏后脑损伤保护的确切关系及Akt/GSK-3β介导的信号通路是否参与调控Nrf2的表达并影响复苏后神经功能,我们拟从体内和体外两个层面进行实验干预,首先观察低温对复苏后大鼠海马Nrf2的表达水平影响,然后体外分离培养SD大鼠海马原代神经元细胞,建立海马神经元缺血/再灌注模型,通过RNA干扰技术和使用通路抑制剂,检测Nrf2的上游及下游信号分子GSK-3β及HO-1水平,结合细胞内活性氧(ROS)及细胞凋亡检测,探讨Akt/GSK-3β/Nrf2通路是否参与了低温对缺血/再灌注海马神经元的保护作用。第一部分低温对心肺复苏后大鼠海马组织Nrf2表达的影响目的:研究气管夹毕窒息致CA/CPR大鼠海马组织中Nrf2的表达,探讨Nrf2的表达水平与复苏后神经功能关系及低温干预对其影响。方法:健康雄性SD大鼠按随机数字法分为假手术组(sham group)、常温心肺复苏组(NT group)和低温心肺复苏组(HT group)。对照组6只,常温心肺复苏组和低温心肺复苏组按24h和72h两个时间点分为两个亚组,即常温心肺复苏24h组(NT-24 group),低温心肺复苏24h组(HT-24 group),常温心肺复苏72h组(NT-72group),低温心肺复苏72h组(HT-72 group),每组10只,共计46只。动物称重后,1%戊巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉,给予固定、剃毛、经口气管插管、股动静脉置管等操作。多通道生理信号采集处理系统监测心率(HR)和平均动脉压(MAP),测定基线动脉血气分析。采用气管夹毕窒息致CA/CPR模型,以收缩压降至25mmHg持续5min为CA时间,然后开始机械通气和胸外按压,按压1min后给予10ug/kg肾上腺素静推。记录常规复苏参数,持续记录肛温、HR和MAP 4 h。复苏成功大鼠按24h和72h两个时间点处死,对照组在完成外科准备后处死。观察海马组织光镜和电镜变化,分光光度计法检测海马组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,westernblot法检测海马组织内caspase-3和nrf2蛋白水平,观察复苏后24h和72h神经功能缺损评分(nds)。结果:1.各组之间基线体重、hr、map、温度、ph、pao2、paco2及lac比较差异无统计意义。各组之间复苏相关参数比较差异无统计学意义。各组之间复苏成功率和观察时间点存活率差异无统计学意义。各组间复苏后观察时间内hr和map差异无统计学意义。2.ht组观察时间内核心温度较nt组明显降低。3.ht组和nt组海马神经元形态学、细胞核和线粒体超微结构较对照组明显改变。ht-24组海马神经元与nt-24组比较损伤明显减轻。4.ht组和nt组mda含量和sod活性较对照组明显增加。ht-24组大鼠海马mda含量较nt-24组明显降低,sod活性较nt-24组明显增高。5.ht组和nt组caspase-3蛋白较对照组明显增加。ht-24组大鼠海马caspase-3蛋白表达水平较nt-24组明显降低。6.ht组和nt组总nrf2蛋白和胞核nrf2蛋白较对照组明显增加,胞浆nrf2蛋白明显较少。ht-24组总nrf2和胞核nrf2蛋白较nt-24组明显增加,胞浆nrf2蛋白较nt-24组明显减少。7.ht组和nt组nds明显低于对照组。ht-24组较nt-24组nds明显提高。结论:复苏后大鼠海马组织内nrf2表达水平明显上调,存在明显的氧化应激损伤、细胞凋亡和神经功能损伤。低温治疗可促进nrf2表达水平进一步上调,并促进nrf2由细胞浆转移至细胞核,缓解氧化应激损伤、细胞凋亡和神经功能损伤。第二部分akt/gsk-3β/nrf2通路在低温保护缺血/再灌注海马神经元中的作用目的:通过观察低温对缺血/再灌注海马原代神经元细胞的作用,探讨akt/gsk-3β/nrf2通路是否参与了低温对缺血/再灌注海马神经元的保护作用。方法分离培养胎鼠原代海马神经元,免疫荧光鉴定海马神经元。通过缺氧/复氧方法建立海马神经元缺血/再灌注模型,分为对照组(controlgroup),缺氧组(hypoxiagroup),低温组(hypothermiagroup),缺氧低温组(hypoxia/hypothermiagroup)。qt-pcr法和westernblot法分别检测海马神经元gsk-3β、nrf2和ho-1的基因和蛋白表达水平,荧光染料及激光共聚焦显微镜检测海马神经元活性氧(ros)水平,annexinv/pi法检测神经元凋亡。然后在缺血再灌注/模型建立前分别给予shnrf2干扰nrf2表达和wortmannin抑制akt/gsk-3β通路,观察上述指标的变化情况。结果:1.通过MAP-2免疫荧光染色对海马神经元进行鉴定,我们选取培养7d海马神经元进行后续实验。2.缺氧低温组较缺氧组总体及胞核Nrf2表达水平明显增高,而胞浆Nrf2表达水平明显降低。缺氧低温组较缺氧组HO-1和p-GSK-3β表达水平明显增高。缺氧低温组较缺氧组ROS含量明显减少,细胞凋亡明显减轻。3.预先加入shNrf2,各组间Nrf2和HO-1表达水平均无明显差异。缺氧低温组较缺氧组p-GSK-3β表达水平明显增高。缺氧低温组和缺氧组ROS含量和细胞凋亡无明显差异。4.预先加入wortmannin,各组间Nrf2、HO-1和p-GSK-3β的表达水平均无明显差异。缺氧低温组和缺氧组ROS含量和细胞凋亡无明显差异。结论:低温通过促进缺血/再灌注海马神经元细胞内Akt磷酸化,加快GSK-3β磷酸化而使其失活,使GSK-3β对Nrf2负向调控作用减弱,诱导其下游信号分子HO-1的表达,缓解氧化应激损伤及细胞凋亡,最终发挥神经保护作用