【摘 要】
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第一部分:人钙化性主动脉瓣中Sam68的表达及自噬水平改变目的:检测人钙化性主动脉瓣膜与对照组标本,比较Sam68的表达变化,明确主要表达Sam68的细胞类型,同时检测钙化瓣膜组织自噬水平的改变,方法:经过华中科技大学同济医学院伦理委员会申请批准,参考ESC/EACTS联合发表的《心脏瓣膜病管理指南》,选取主动脉瓣中到重度狭窄的CAVD患者,获取术后钙化性人主动脉瓣组织切片,茜素红染色检测瓣膜组织
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81770387）; 国家重点研发计划项目（2016YFA0101100）
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第一部分:人钙化性主动脉瓣中Sam68的表达及自噬水平改变目的:检测人钙化性主动脉瓣膜与对照组标本,比较Sam68的表达变化,明确主要表达Sam68的细胞类型,同时检测钙化瓣膜组织自噬水平的改变,方法:经过华中科技大学同济医学院伦理委员会申请批准,参考ESC/EACTS联合发表的《心脏瓣膜病管理指南》,选取主动脉瓣中到重度狭窄的CAVD患者,获取术后钙化性人主动脉瓣组织切片,茜素红染色检测瓣膜组织钙盐沉积程度;免疫组化染色、WB法检测Sam68表达和自噬水平的变化;免疫荧光染色检测Sam68与AVICs共定位。结果:人钙化性主动脉瓣组织茜素红染色阳性,提示大量钙盐沉积形成钙化结节。WB（P<0.05）和Real-time PCR（P<0.01）法检测Sam68表达明显增加,免疫荧光染色发现与AVICs存在大量共定位。同时人钙化性主动脉瓣组织WB检测LCⅡ/Ⅰ与对照组相比差异不明显,但P62蛋白明显堆积（P<0.01）,提示自噬流受阻。结论:人钙化性主动脉瓣膜组织中Sam68表达明显上调,且与AVICs存在共定位。人钙化性主动脉瓣组织中存在自噬流受阻现象。第二部分:Sam68参与调控主动脉瓣膜间质细胞自噬促进其成骨表型转化目的:探究Sam68是否参与调控AVICs自噬,促进成骨表型转化。方法:体外原代培养AVICs,予以TNF-α诱导建立体外细胞钙化模型。通过LC3-GFP-RFP慢病毒转染和WB检测TNF-α刺激AVICs自噬流变化,进一步调控自噬流后观察AVICs成骨表型转化,探讨自噬参与AVICs成骨表型转化的过程。过表达和敲低Sam68后联合TNF-α刺激,对比单纯TNF-α干预组和空白对照组的成骨标志物ALP、Runx2表达及自噬流改变。结果:体外细胞实验表明TNF-α刺激AVICs成骨表型转化,WB检测LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加（P<0.01）,P62堆积更明显（P<0.05）;LC3-GFP-RFP双荧光标记显示自噬小体增加,但自噬溶酶体减少（P<0.05）,提示自噬启动但自噬流受阻。使用雷帕霉素进一步激活自噬,明显减缓TNF-α诱导的成骨表型转化。过表达Sam68较单纯TNF-α干预组LC3Ⅱ/Ⅰ表达差异不明显,但P62蛋白明显堆积（P<0.05）,LC3-GFP-RFP双荧光标记显示自噬小体及自噬溶酶体明显减少（P<0.001）,提示过表达Sam68后进一步阻碍AVICs自噬流;而敲低Sam68后LC3Ⅱ蛋白增加,且P62堆积减少（P<0.05）,自噬小体及自噬溶酶体数量明显增加（P<0.01）,提示敲低Sam68加速自噬流。过表达Sam68检测ALP、Runx2表达增加（P<0.01）;茜素红检测钙盐沉积明显增加（P<0.05）,促进AVICs成骨表型转化;而敲低Sam68后则ALP、Runx2表达降低（P<0.05）,茜素红检测钙盐沉积明显减轻（P<0.05）,改善成骨表型转化。结论:Sam68阻碍AVICs自噬流促进其成骨表型转化,而敲低Sam68可以加速自噬流改善成骨表型转化。第三部分:Sam68调控主动脉瓣膜间质细胞自噬的机制探究目的:探讨Sam68阻碍AVICs自噬的机制。方法:敲低Sam68后检测TNF-α刺激AVICs的NF-κB和STAT3磷酸化水平,同时检测STAT3下游基因Bcl2的表达,自噬相关蛋白Beclin1,ATG7的表达;STRING数据库分析预测Sam68互作蛋白,免疫共沉淀法检测Sam68与STAT3之间相互作用。结果:TNF-α刺激AVICs的NF-κB磷酸化水平在2min明显上升,缓慢降至平台期,10min以后稳定,Sam68敲低后并不影响TNF-α激活的P65磷酸化水平。TNF-α刺激AVICs 2min时STAT3磷酸化水平明显上调,随后缓慢下降,2h时再次上升;敲低Sam68后TNF-α刺激的STAT3磷酸化水平2min时不上升（P<0.01）,随后缓慢下调,2h时缓慢上调程度较单纯TNF-α刺激明显减弱（P<0.01）,但变化趋势一样。敲低Sam68后STAT3下游分子Bcl2基因表达下调,且其互作分子Beclin1,自噬上游关键蛋白ATG7进一步上调。通过STRING蛋白互作数据库分析提示Sam68和STAT3存在相互作用可能。免疫共沉淀法验证在AVICs中Sam68与STAT3的确具有相互作用。结论:Sam68与STAT3在AVICs中存在相互作用,Sam68影响TNF-α诱导的STAT3磷酸化水平,这可能是Sam68阻碍AVICs细胞自噬流的重要机制。
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