目的失血性休克（Hemorrhagic Shock,HS）是创伤后导致病人致死的主要原因。急性重症失血性休克导致的各组织器官持续低灌流状态,甚至引发机体内环境代谢障碍,进一步导致多脏器功能障碍综合征甚至危及生命。在HS的发展过程中,存在着组织灌流不足引发的缺血缺氧,氧化呼吸链受阻,线粒体的能量代谢障碍。失血性休克引起一系列病理生理的变化,包括干扰微循环、局部血液灌注减少,组织缺氧和代谢紊乱。近年来的研究显示,虽然失血性休克病人最终的致死原因很多,但是许多基础和临床证据表明,线粒体的功能不全在HS的发展过程中起着非常重要的作用,线粒体功能障碍的程度与急性重症失血性休克患者的死亡率密切相关。虽然在治疗时,经过大量的液体复苏,各脏器的血流恢复灌注、氧和营养物质恢复供给,但是这一缺血再灌注的过程会导致大量活性氧族（reactive oxygen species,ROS）的产生,这会进一步加剧线粒体功能的损伤。短时间内严重的缺血再灌注损伤会破坏线粒体膜结构的蛋白质,加速线粒体通透性转变孔的开放,使膜内外的平衡被打破,增加细胞色素C向胞浆释放,这一进程会加速细胞的凋亡。然而,无论是否进行外科手术和液体复苏,急性重症失血性休克时由于缺血缺氧导致的线粒体功能不全,都会导致进一步的器官损伤,因而,在治疗过程中改善线粒体功能,降低氧化应激,是治疗失血性休克的重要靶点之一。失血性休克恢复血液灌流和维护组织供氧是HS复苏后的主要目标。即便如此,即使在传统的复苏目标实现之后,病人常死于全身炎症反应和多器官功能障碍综合征。在严重休克的条件下,胃和肠进行连续的血管收缩,血流灌注明显减少。值得注意的是,肠在重症失血性休克和肠缺血/再灌注（I/R）损伤的病理生理的改变中起着关键的作用。肠道作为重要的消化、吸收器官,除此之外,更具有强大的分泌和屏障功能。肠道屏障（intestinal barrierfunction,IBF）作为天然免疫的重要器官,越来越受到临床和基础研究的关注。有文献表明,许多疾病中肠道屏障功能受损进而引起的菌群移位和紊乱,容易导致全身炎症反应综合征的发生。在急性重症失血性休克的病变中,由于失血再灌注引起的小肠上皮细胞广泛坏死、绒毛脱落、基底膜瓦解,屏障破坏,而这一过程加速了肠内菌群失调,进入全身血循环并最终引发各种炎性细胞因子的产生和内毒素的释放。因此也有文献指出,肠道是引发各种疾病导致的多器官功能衰竭的"motor"。在抢救中低温治疗在实验和临床应用中已经被广泛报道,通过适度冷却,诱发低温可保护大脑,心脏,肺癌,和肠用以治疗I/R损伤或其它疾病。迄今为止的研究显示,低温治疗机制与线粒体保护,自由基还原,和免疫反应的抑制有关。然而,大多数的焦点对线粒体保护的原因是由于低温引发的强心效果。低温参与肠上皮细胞线粒体每次缺血再灌注的具体机制,特别是休克的条件下,仍不清楚。此外,最佳的目标温度仍有争议。为了解决上述问题,我们采用了严重的失血性休克/再灌注（hemorrhagic shock/reperfusion,HS/R）模型,并比较了两种低温处理（32℃和34℃）的一般生存时间的影响,平均动脉压（MAP）、肠组织损伤,特别是小肠上皮细胞的线粒体功能。炎症反应是人体的重要保护机制,在失血性休克中,往往会产生过度的炎症反应,造成促炎-抗炎稳态的失衡,进而引起自身细胞的损伤。在急性重症失血性休克后的感染刺激后,机体内环境释放炎症介质引起SIRS,促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白细胞介素-l（interleukin-1,IL-1）、IL-6、IL-8等。机体在释放促炎介质同时,也释放内源性抗炎介质,如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13等,引起代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS）,CARS 可导致机体免疫功能损害。低温可以介导炎性免疫反应中的各环节,降低许多炎性介质,如ROS、活性氮类以及诸多的粗炎症因子的水平,并且通过抑制转录调节因子NF-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的核转移,进而抑制其下游多种蛋白的表达。因此,低温具有明显的炎症抑制作用,这也可能是在各种创伤的治疗过程中,亚低温效用的主要作用机制。在机体内环境中,低温从多种水平直接影响了代谢,因而有效的保护组织和器官的生理学功能,并对组织的再生和修复有着促进的作用。在临床治疗中,低温联合药物治疗有着广阔的应用前景。然而,尽管从多种动物实验层面证明了亚低温治疗的保护作用,该技术手段在临床应用中仍然存在许多局限,如:如何在不同疾病模型中选择最为有效的亚低温治疗温度,如何避免不良反应,如何控制亚低温介入的时间,如何评价亚低温联合药物治疗的效果等等。尽管低温治疗存在争议,但是浅低温有益的治疗效果在很多的动物实验中得到证实,不过低温复苏对于失血性休克后肠损伤是否有保护作用尚未见报道。为此,我们做出假设:1、轻度低温联合限制性液体复苏能够减少失血性休克再灌注后肠道损伤,2、失血性休克后浅低温治疗效果和肠细胞线粒体保护有关。方法1.大鼠失血性休克模型复制和再灌注后小肠上皮细胞线粒体的损伤大鼠称重麻醉后,留置PE管,其中股静脉管用于放血、给药和回输自体血,股动脉管用于开始的血压监测。经股静脉的PE-50管缓慢抽血,在l0min内将血压放到45mmHg左右,监测血压并将其控制在40±5mmHg,维持时间为120min,期间血压上升且超过50mmHg则持续缓慢放血,若血压发生下降且超出45mmHg则从抽血的注射器缓慢推注,回输大鼠自体血。在失血性休克维持2小时后之后回输全部自体血。随后进行的液体复苏（林格氏溶液）在15mL/kg/h下进行,并保持2小时。1.1生存时间和生存率观察大鼠常温放置10小时后,缝合并放回到笼子中,观察其存活时间。观察各组生存时间（每小时观察1次,以72小时为观察终点）,计算各组72小时的生存率。1.2小肠组织和血清样品制备取材位置:距离屈氏韧带10厘米处采集回肠10厘米。分别收集小肠节段、肠粘膜,并采集动脉血液。1.3小肠上皮细胞的病理鉴定按照HE染色步骤进行染色。显微镜下观察小肠黏膜损伤的发病机理,使用Chiu评分系统进行评估。1.4小肠上皮细胞线粒体跨膜电位△ψm水平、ATP水平的测定使用JC-1荧光染料并用FlowJo软件进行平台获取,计算发射黄绿色荧光的单体形式JC-1（低线粒体跨膜电位细胞）占细胞百分数（%）。结果使用FlowJo7.6分析数据。结果为绿色到红色（单体/聚集体）（N=6）的比例的荧光。ATP的测定是采用Spectra Max M5酶标仪检测荧光强度,单位是（RLU）。结果为各样本（N=6）吸光强度（OD值）。1.5细胞色素C的核内和胞质的Western Blot分析将胶片进行拍照,使用ImageJ系统处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。1.6统计学处理采用SPSS20.0统计分析软件进行数据统计,实验数据用均数±标准差（x±s）表示。通过单向方差分析法,采用SPSS软件Tukey多重比较法检验统计分析。P<0.05则认为具有显著统计学意义。2大鼠失血性休克及再灌注后的低温治疗对改善肠线粒体功能损伤的作用大鼠称重麻醉后,留置PE管,其中股静脉管用于放血、给药和回输自体血,股动脉管用于开始的血压监测。经股静脉的PE-50管缓慢抽血,在1Omin内将血压放到45mmHg左右,监测血压并将其控制在40±5mmHg。在失血性休克维持2小时后之后回输全部自体血。随后进行的液体复苏（林格氏溶液）在15mL/kg/h下进行,并保持2小时。使用不同的控制温度下在2小时复苏周期（使用冰袋上腹部或热床垫）,将大鼠随机分成对照组（假手术组）、32℃复苏组、34℃复苏组、37℃复苏组。通过直肠监测各组动物的体温。完成后,将24只大鼠（每组6只）处死线粒体功能测定,氧化应激试验,和细胞凋亡分析。剩余的64大鼠（每组n =16）用于观测MAP和生存时间分析。2.1生存时间和生存率观察64只大鼠常温放置10小时后,缝合并放回到笼子中,观察其存活时间。观察各组生存时间（每小时观察1次,以72小时为观察终点）,计算各组72小时的生存率。2.2小肠组织和血清样品制备取材位置:距离屈氏韧带10厘米处采集回肠10厘米。分别收集小肠节段、肠粘膜,并采集动脉血液。2.3小肠上皮细胞的病理鉴定按照HE染色步骤进行染色。显微镜下观察小肠黏膜损伤的发病机理,使用Chiu评分系统进行评估。2.4小肠上皮细胞线粒体跨膜电位△ψm水平、ATP水平的测定使用JC-1荧光染料并用FlowJo软件进行平台获取,计算发射黄绿色荧光的单体形式JC-1（低线粒体跨膜电位细胞）占细胞百分数（%）。结果使用FlowJo7.6分析数据。结果为绿色到红色（单体/聚集体）（N =6）的比例的荧光。ATP的测定是采用Spectra Max M5酶标仪检测荧光强度,单位是（RLU）。结果为各样本（N=6）吸光强度（OD值）。2.5小肠上皮细胞线粒体膜通透性转变孔（mPTP）的状态和线粒体氧化损伤的测定采用流式细胞仪进行定量检测,每个样本获取10000个细胞,用FlowJo软件进行平台获取并分析数据,以细胞平均绿色荧光强度衡量线粒体通透性转变孔的状态。2.6 TUNEL 检测使用DeadEndTM荧光TUNEL系统,以检测细胞凋亡水平。荧光素-12-dUTP的标记的DNA,在显微镜下观察。凋亡指数为TUNEL阳性细胞相对于细胞总数量的比值,在200×倍镜下观察。凋亡指数取每组五个非重叠视野的平均值（每组6只）。2.7细胞色素C的核内和胞质的Western Blot分析将胶片进行拍照,使用ImageJ系统处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。2.8血清炎症介质的测量使用ELISA法,以M5酶标仪在450nm波长处检测各孔的光密度值（OD值）。2.9统计学处理使用GraphPad Prism6.04和SPSS20.0分析数据。生存曲线趋势进行分析,并用对数秩检验进行比较。其它结果表示为平均值±标准差;通过单因素方差分析,随后通过Tukey的多重比较检验进行统计分析。P<0.05被认为具有统计学意义。结果1大鼠失血性休克再灌注后,出现线粒体功能不全和生存时间的显著降低。1.1失血性休克再灌注后,大鼠生存时间分析为探讨失血性休克/再灌注模型是否复制成功,各组大鼠再灌注及液体复苏后均被放置在单独的笼子,用来观察72h生存时间。对照组（正常组）的10只大鼠在24h、36h和48h三个观察时间点均处存活状态,生存率均为100%。HS/R处理的大鼠均有不同时间的死亡。其中,前24小时6只大鼠死亡,48小时内8只大鼠死亡,两个时间点的生存率分为40%和20%,72h观察时间段的平均生存时间是 34.00±5.18h。1.2失血性休克再灌注后,大鼠小肠上皮细胞线粒体变化失血性休克再灌注后,JC-1单体/聚合体的比例显著增加（t= 9.13084,P=0.000）,该结果表明,失血性休克再灌注后,大鼠小肠上皮细胞线粒体跨膜电位下降。采用荧光素-荧光素酶法检测了细胞内ATP的含量,结果证实,失血性休克后大鼠组的荧光强度减弱,提示该组ATP含量下降,线粒体功能下降。（t=6.27,p=0.000）采用流式细胞技术分析Calcein-AM的荧光后发现,与正常对照组相比较,失血性休克再灌注后的大鼠小肠上皮细胞黄绿色钙黄绿素荧光下降了29%（t=16.63,p=0.000）2失血性休克及再灌注后的低温治疗能够改善肠线粒体功能损伤2.1低温对肠细胞线粒体功能的影响为了探索低温对肠细胞损伤的可能机制,我们首先测定线粒体功能,即线粒体膜电位、细胞ATP、和线粒体通透性转变孔的开放程度。在37℃组迅速增加的JC-1单体/聚集比值显示,该组线粒体膜电位急剧下降。相比之下,JC-1单体/聚合态在32℃和34℃低温治疗组有部分的恢复（P值均<0.01）。此外,在37℃治疗组小肠上皮细胞ATP含量相对于假手术组下降了 48%,在34℃和32℃两组相对于假手术组,恢复到59%和76%,p值分别为（P<0.05和 P<0.01）。类似的结果中观察到线粒体通透性转变孔的开放程度,与假手术组相比,钙黄绿素的荧光降低了 48%,相对于假手术组,在34℃组和32℃组恢复到67%和 79%,分别为 P=0.09 和 P<0.01,图 1C)。2.2低温对氧化应激影响一系列细胞通路参与了缺氧损伤的发生;低温可以终止其中一个或多个,以此来防止细胞膜和自由基的损伤。因此,我们测量了线粒体抗氧化酶的含量,即GSH,GSSG和MDA。在37℃组小肠组织匀浆中,GSH含量显著降低。诱导低温治疗可以部分降低氧化酶的增加,恢复降低抗氧化酶,特别是在32℃组,其中抗氧化酶活性得到有效恢复。2.3低温对肠道病理变化及细胞凋亡的影响通过HE染色观察肠道病理变化。在37℃干预组会发生严重的肠道损伤,镜下可以见到肠上皮脱落,叶片暴露,并在裸露绒毛出血。32℃组只有扩大皮下空间,并在局灶性上皮破坏;34℃组的病理变化相对略差（图3A）。在与组织学观察结果相一致,CHIU得分情况,37℃组显著低于32℃组与34℃组（P<0.01 或 P<0.05）。我们分析了细胞凋亡的水平,并计算凋亡指数。值得注意的是,相对于37℃组,小肠上皮细胞凋亡在32℃组（P<0.01）下降了 48.2%。同样,在34℃组细胞凋亡也减少了;然而,在32℃和34℃组间差异没有显著意义。诱导低温治疗可以使线粒体细胞色素C含量一定程度的恢复,而胞浆细胞色素C含量则有所降低;在34℃下处理相对于在32℃处理有卓越的治疗效果,显示线粒体细胞色素C的含量（P=0.16）上升了 14%,而胞浆细胞色素C的含量下降 14%（P<0.05）。2.4低温对全身炎症反应的影响在本实验中,我们测定小肠组织中的MPO浓度,发现在37℃组的大鼠MPO水平显著增加。相比之下,低温治疗可以一定程度的降低MPO（均P<0.01）,而在32℃组相比于34℃组（P=0.01）下降了 40%。根据既往报告,亚低温调控可以导致迟发性细胞死亡下游炎症通路,我们测定了促炎血清细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的含量。再灌注后2小时,32℃下诱导低温治疗有效降低（所有P<0.01）促炎细胞因子水平。值得注意的是,在34℃组没有显著炎症反应的抑制。2.5低温对平均动脉压和生存时间的影响要验证亚低温对休克引起的肠道损伤所致的影响,我们评估的大鼠的一般状况,即MAP和存活时间。正如预期的那样,亚低温治疗,特别是32°℃,再灌注之后,在2小时,4小时和10小时,平均动脉压显著增加。此外,亚低温治疗显著延长生存时间,就证明了亚低温治疗增加存活率（32℃、34℃、37℃分别为12/16与10/16和8/16）和生存曲线显著差异（P<0.01）。2.6失血性休克再灌注后,大鼠小肠上皮细胞促凋亡蛋白增加诱导低温治疗可以使线粒体细胞色素C含量一定程度的恢复,而胞浆细胞色素C含量则有所降低;在34℃下处理相对于在32℃处理有卓越的治疗效果,显示线粒体细胞色素C的含量（P=0.16）上升了 14%,而胞浆细胞色素C的含量下降 14%（P<0.05）。结论1.中低温复苏是一种有效的治疗休克引起的肠道损伤的方法,其中,32℃条件下具有明显的优势;2.失血性休克后的中低温复苏的治疗效果,其作用机制可能与线粒体的保护、氧化应激损伤减少、以及细胞凋亡的抑制和全身炎症反应改善相关。