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金黄色葡萄球菌是引发奶牛乳腺炎的主要病原菌之一,它是一种非典型的胞内寄生菌,可以引起细胞炎症并通过释放多种毒素加重细胞感染,尤其是其释放的α-溶血素,在金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺组织的过程中通过破坏细胞膜结构从而导致细胞大量死亡。许多研究发现,通过中和作用或抑制毒力因子的分泌就能达到缓解炎症发生,许多中药已经被证明具有很好的中和细菌毒素、抑制细菌毒力蛋白分泌和消除炎症的作用。本课题通过研究苦参碱对产α-溶血素金黄色葡萄球菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的干预作用,从而为研究中药干预病原菌损伤宿主细胞的机制奠定基础。首先用二倍稀释法和紫外分光光度计法测定苦参碱对金黄色葡萄球菌的药物敏感性及其对细菌生长的影响;用家兔红细胞溶血实验检测苦参碱对金黄色葡萄球菌α-溶血素活性的影响、实时荧光定量PCR法及Western Bloting检测苦参碱对金黄色葡萄球菌分泌α-溶血素的影响;用CCK-8法和流式细胞仪检测苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和金黄色葡萄球菌诱导其凋亡的影响;本课题重点研究苦参碱对金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞的影响并确认其发挥调控作用的通路。发现苦参碱对金黄色葡萄球菌的MIC在1.25 mg/mL-5 mg/mL;苦参碱在16μg/mL-256μg/mL的使用浓度下能够显著下调α-溶血素编码基因hla的转录水平从而降低金黄色葡萄球菌α-溶血素的分泌量。产α-溶血素金黄色葡萄球菌株对奶牛乳腺上皮细胞的损伤作用大于α-溶血素基因缺失株;75 μg/mL苦参碱能够显著降低金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡(p<0.05)。苦参碱(25 μg/mL-75μg/mL)能够干预金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺上皮细胞释放NO,抗菌肽TAP、BNBD5及细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表达,其中75μg/mL苦参碱组的干预作用最显著(p<0.01);苦参碱能够剂量依赖性的减少入侵奶牛乳腺上皮细胞的金黄色葡萄球菌的数量;金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞后激活NF-κB信号通路,而苦参碱能够剂量依赖性的降低细胞核内p65蛋白含量;阻断NF-κB信号通路后发现苦参碱与NF-κB抑制剂作用相似,均能抑制金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞。结果表明苦参碱可以抑制金黄色葡萄球菌分泌α-溶血素,也能够干预金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞的损伤;进一步发现这一干预作用与金黄色葡萄球菌是否分泌α-溶血素无关;苦参碱可以通过下调NF-κB通路p65蛋白表达水平,从而调控下游相关通路干预金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞,且这种干预作用与苦参碱浓度正相关。