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目的:锰是维持机体功能的人体必需微量元素,环境中长期接触或者职业过量锰暴露均会扰乱正常细胞功能,导致氧化应激、线粒体功能障碍、自噬调节紊乱,损害正常的神经功能并引起神经退行性疾病。自噬是真核细胞内高度保守的生命进程,自噬可以清除细胞内错误折叠的蛋白质与受损的细胞器等,维持机体内环境的稳态,自噬异常与神经退行性病变密切相关。mTOR（Mammalian target of rapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）,ULK1是自噬信号通路上的关键分子,mTOR磷酸化后直接负调控ULK1,磷酸化ULK1降低导致自噬抑制。PP2A（Protein Phosphatase 2A,蛋白磷酸酶2A）是真核细胞中最重要的调节细胞自噬、凋亡、细胞周期等多种生理过程的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,通过催化蛋白质去磷酸化参与调节各种生理过程。催化亚基C甲基化赋予合酶活力。PP2Ac（Protein Phosphatase 2A Catalytic subunit C,蛋白磷酸酶2A催化亚基C）甲基化修饰分别受LCMT1（Leucine Carboxyl Methyltransferase 1,亮氨酸甲基转移酶1）和蛋白甲基PPME-1（Protein Phosphatase Methylesterase 1,蛋白磷酸甲基酯酶1）调控。然而PP2A及其甲基化是否参与锰诱导的神经细胞损伤、氧化应激与自噬异常以及潜在机制尚未清晰。本研究通过构建锰暴露于N2a（Neuro-2a,小鼠神经母细胞瘤细胞）的体外模型,研究锰暴露对神经细胞自噬的影响、mTOR信号通路及PP2Ac甲基化的变化,采用ABL-127（3R-Dimethyl3-cyclopentyl-4-oxo-3-phenyl-1,蛋白磷酸酶甲基酯酶抑制剂）、构建LCMT1高表达细胞株、抗氧化剂NAC（N-acetyl-L-cysteine,N-乙酰半胱氨酸）等方式,探索PP2Ac甲基化调控mTOR自噬信号通路在锰抑制神经细胞自噬中的作用机制。方法:1.锰暴露诱导N2a细胞自噬的检测N2a细胞暴露在不同浓度锰（0～2000μmol/L）2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h,按比例稀释溶酶体探针,荧光显微镜观察N2a细胞的溶酶体的数量与分布情况并拍照;染锰6 h、12 h、24 h后,用酶标仪测定N2a细胞溶酶体染色的荧光值,对结果进行量化确定后续进行机制探讨的时间/浓度-效应。刃天青检测锰暴露后N2a细胞活性的变化。蛋白印迹实验检测N2a细胞自噬标志蛋白p62、LC3-Ⅱ/I蛋白表达,总PP2Ac、甲基化PP2Ac,去甲基化PP2Ac蛋白表达;mTOR相关蛋白mTOR、pmTOR、ULK1、p ULK1蛋白表达。2.ABL-127干预缓解锰抑制N2a细胞自噬0.5μM ABL-127与锰共孵育12 h后刃天青检测细胞活性,蛋白印迹实验检测N2a细胞自噬标志蛋白p62、LC3-Ⅱ/I蛋白表达,总PP2Ac、甲基化PP2Ac,去甲基化PP2Ac蛋白表达;mTOR相关蛋白mTOR、pmTOR、ULK1、p ULK1蛋白表达。3.LCMT1过表达对锰抑制N2a细胞自噬的影响构建PCDNA3.0、PCDNA3.0-LCMT1小鼠基因质粒,DH5α感受态细胞对质粒进行转化扩增并将之转染到N2a细胞分别获得LCMT1-PCDNA3.0和空载体PCDNA3.0细胞株并进行鉴定。PCDNA-N2a、LCMT1-N2a细胞分别与不同浓度锰共培养12 h,刃天青检测细胞活性,蛋白印迹实验检测N2a细胞自噬标志蛋白p62、LC3-Ⅱ/I蛋白表达,总PP2Ac、甲基化PP2Ac,去甲基化PP2Ac蛋白表达;mTOR相关蛋白mTOR、pmTOR、ULK1、p ULK1蛋白表达。4.抗氧化剂NAC对锰抑制N2a细胞自噬的影响检测野生型N2a细胞单独暴露于锰,或与ABL-127、NAC共培养,PCDNA-N2a与LCMT1-N2a细胞染锰12 h后ROS水平。NAC预处理N2a细胞2 h后,锰暴露12 h,刃天青检测细胞活性,蛋白印迹实验检测N2a细胞自噬标志蛋白p62、LC3-Ⅱ/I蛋白表达。结果:1.锰暴露抑制N2a细胞自噬的机制研究:（1）随着锰浓度的升高,N2a细胞形态皱缩,突起减少。N2a细胞活性与锰浓度呈剂量依赖性降低趋势,500μmol/L、1000μmol/L、2000μmol/L锰组与对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）锰暴露导致溶酶体生成增加,且浓度越高,暴露时间越长,异常溶酶体生成越多,与对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）氯喹干预N2a细胞,最适合处理浓度为50μmol/L,最适合干预时间为2 h。（4）锰暴露后pmTOR,p62,LC3-Ⅱ/I蛋白表达上升,p ULK1蛋白表达下降,与对照组比较,P<0.05,差异具有统计学意义。（5）与单独染锰组相比,氯喹干预组自噬标志蛋白p62与LC3-Ⅱ/I蛋白表达水平显著增加（P<0.05）。（6）锰暴露使N2a细胞PP2Ac甲基化蛋白表达下降,去甲基化蛋白表达上升,与对照组比较,P<0.05,差异具有统计学意义。2.ABL-127干预缓解锰抑制N2a细胞自噬:（1）ABL-127可保护锰诱导的N2a细胞损伤,与单独染锰组相比,ABL-127干预组的细胞形态在高浓度染锰情况下细胞形态维持的较好,突起减少或者消失的细胞相对较少,且正常细胞数量较多;除对照组外,ABL-127干预组的细胞存活率显著增加（P<0.05）,（2）与单独染锰组相比,ABL-127干预组pmTOR、p62、LC3-Ⅱ/I蛋白表达量下降,p ULK1蛋白表达量上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;同时,总PP2Ac蛋白表达量不变,PP2Ac去甲基化蛋白表达量下降,甲基化蛋白表达水平上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.LCMT1过表达对锰暴露诱导N2a细胞自噬的作用:（1）与PCDNA-N2a相比,LCMT1-N2a组的LCMT1基因表达水平增加;LCMT1、PP2Ac甲基化蛋白表达水平增加、PP2Ac去甲基化蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）与PCDNA-N2a组相比,LCMT1-N2a组的细胞形态在高浓度染锰时细胞形态维持的较好,突起减少或者消失的细胞相对较少,且正常细胞数量较多;除对照组外,LCMT1-N2a组的细胞存活率显著增加（P<0.05）,以上与ABL-127干预结果趋势一致。（3）与PCDNA-N2a组相比,LCMT1-N2a组pmTOR、p62、LC3-Ⅱ/I蛋白表达量下降,p ULK1蛋白表达量上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。同时,总PP2Ac蛋白表达量不变,PP2Ac去甲基化蛋白表达量下降,甲基化蛋白表达水平上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.氧化应激参与PP2Ac甲基化调控锰抑制的细胞自噬:（1）不同浓度NAC处理N2a 2 h,N2a在NAC浓度为2、4、8、10 mmol/L时,增加N2a细胞活性,P<0.05,差异具有统计学意义,1 mM为NAC对N2a的最适宜处理浓度。（2）与单独染锰组相比,除对照组外,NAC干预组的细胞存活率增加,P<0.05,差异具有统计学意义。（3）锰暴露12 h使N2a细胞ROS水平增加,锰浓度与N2a细胞内ROS水平呈剂量反应关系,P<0.05,差异具有统计学意义。与单独染锰组相比,ABL-127、NAC干预组细胞内ROS水平均显著下降（P<0.05）;与单独染锰组相比,除0μmol/L锰组外,NAC干预组细胞内ROS水平下降,P<0.05,差异具有统计学意义;锰暴露后LCMT1-N2a细胞内ROS水平比PCDNA-N2a显著降低（P<0.05）,差异具有统计学意义。（4）与单独染锰组相比,NAC干预组的自噬标志蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达量显著下降（P<0.05）。结论:1.锰暴露抑制N2a细胞自噬,该抑制与锰激活mTOR/ULK1信号通路有关。锰使PP2Ac甲基化下降,去甲基化升高。2.ABL-127抑制PP2Ac去甲基化及LCMT1过表达上调PP2Ac甲基化均可缓解锰诱导的N2a细胞自噬抑制。3.PP2Ac去甲基化修饰抑制N2a自噬与锰诱导ROS水平升高有关;ABL-127、NAC干预、LCMT1过表达均能降低锰暴露导致的细胞损伤与氧化应激;抗氧化剂NAC缓解锰抑制的N2a细胞自噬。