论文部分内容阅读
目的:（1）通过体外实验,观察肾小管上皮细胞自噬、炎症及上皮-间充质转化相关指标的变化,明确调控自噬,改善糖尿病肾病肾小管上皮细胞炎症及上皮-间充质转化的机制。（2）体外高糖环境下培养大鼠肾小管上皮细胞,调控SIRT1的表达,观察肾小管上皮细胞自噬、炎症及上皮-间充质转化等相关指标的变化,明确SIRT1/NF-κB信号通路参与高糖诱导的NRK-52E细胞自噬及炎症损伤的机制。（3）通过网络药理学分析及分子对接方法,挖掘中药黄芪治疗糖尿病肾病的潜在靶点,从多方面阐明黄芪治疗糖尿病肾病的作用机制。（4）通过体内外实验,探究黄芪甲苷干预SIRT1/NF-κB信号通路,改善自噬障碍,抑制炎症反应,改善高糖环境下NRK-52E细胞上皮-间充质转化,改善DN肾间质纤维化的作用机制。方法:第一部分:体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,结合国内外研究及课题组前期研究中不同葡萄糖浓度培养条件下NRK-52E细胞增殖的情况,选择30mmol/L葡萄糖浓度作为高糖组浓度,进行下一步实验。细胞分为正常组（N）、高糖组（HG）、高糖+自噬激活剂（雷帕霉素）组（HG+Ra）和高糖+自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤）组（HG+3-MA）,培养24小时,分别收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA。采用Western blotting和定量RT-PCR检测自噬指标（P62、Beclin-1、LC3）、炎症指标（乙酰化NF-κB p65、MCP-1、IL-1β）和上皮-间充质转化指标（FN、α-SMA）的表达。第二部分:培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,分为正常组（N）、高糖组（HG）、高糖+SIRT1激活剂（白藜芦醇）组（HG+R）和高糖+SIRT1抑制剂（Ex-527）组（HG+Ex-527）,培养24小时,分别收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA。采用细胞免疫荧光检测各组SIRT1的表达。采用Western blotting和定量RT-PCR检测SIRT1、自噬指标（P62、Beclin-1、LC3）、炎症指标（乙酰化NF-κB p65、MCP-1、IL-1β）和上皮-间充质转化指标（FN、α-SMA）的表达。第三部分:通过TCMSP、TCMID等数据库获取得到中药黄芪的活性组分及靶点;糖尿病肾病的主要治疗靶点通过Gencards、OMIM、TTD、Dis Ge NET等数据库检索。取药物和疾病的靶点交集进行蛋白相互作用分析,用String平台构建PPI网络,通过Cytoscape 3.7.2软件对PPI网络进行可视化分析,并筛选出PPI核心网络蛋白。采用Metascape平台进行GO及KEGG富集分析,获得“药物-成分-靶点”参与的生物过程及信号通路。利用Cytoscape3.7.2软件构建“中药黄芪-DN靶点-信号通路”网络,选取药物主要活性成分及核心靶点,通过Auto Dock Tools 1.5.6软件进行分子对接验证。第四部分:离体培养NRK-52E细胞,分为正常组、高糖组、高糖+黄芪甲苷（AS-Ⅳ）组（HG+AS-Ⅳ）和高糖+SIRT1激活剂（白藜芦醇）组（HG+R）。培养24小时,收集细胞提取总蛋白和总RNA。采用细胞免疫荧光检测SIRT1的表达,采用Western blotting和定量RT-PCR检测SIRT1、自噬指标（P62、Beclin-1、LC3）、炎症指标（乙酰化NF-κB p65、MCP-1、IL-1β）和上皮-间充质转化指标（FN、α-SMA）的表达。第五部分:选择雄性8周龄SD大鼠40只,随机分为正常组（N）和造模组。采用右肾切除联合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制作DN大鼠模型。造模成功的大鼠随机分为糖尿病肾病组（DN）、黄芪甲苷治疗组（AS-Ⅳ）及白藜芦醇治疗组（R）,每组10只。N组和DN组大鼠给予注射用水5ml/kg/d灌胃,AS-Ⅳ组给予黄芪甲苷40mg/kg/d灌胃,R组给予白藜芦醇灌胃液20mg/kg/d灌胃,连续饲养8周。（1）动态观察各组大鼠治疗前、治疗后4周、治疗后8周的一般状况,包括毛发状况、尿量、排便情况、活动度、反应性等;（2）检测各组大鼠治疗前、治疗后4周、治疗后8周的生化指标,包括血糖（GLU）、24小时尿蛋白定量（24UTP）,血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）;（3）治疗8周末留取各组大鼠肾脏组织,行HE染色、PAS染色、PASM染色及Masson染色,光镜观察各组大鼠肾脏组织病理改变;（4）治疗8周末留取各组大鼠肾脏组织,提取肾脏组织的总蛋白及总RNA,采用免疫组化、Western blotting和定量RT-PCR检测SIRT1、自噬指标（Beclin-1、LC3、P62）、炎症指标（乙酰化NF-κB p65、MCP-1、IL-1β）和纤维化指标（FN、α-SMA）的表达。结果:第一部分:（1）30mmol/L葡萄糖培养基干预NRK-52E细胞后,Western blotting及定量RT-PCR结果显示,与N组相比,HG组Beclin-1和LC3表达降低（P＜0.05）,P62表达升高（P＜0.05）,MCP-1、IL-1β、乙酰化NF-κB p65表达升高（P＜0.05）,FN、α-SMA表达升高（P＜0.05）。（2）高糖培养条件下,给予自噬激活剂雷帕霉素干预NRK-52E细胞后,Western blotting及定量RT-PCR结果显示,与HG组相比,Beclin-1和LC3表达升高（P＜0.05）,P62表达降低（P＜0.05）,MCP-1、IL-1β、乙酰化NF-κB p65表达降低（P＜0.05）,FN、α-SMA的蛋白表达降低（P＜0.05）。（3）高糖培养条件下,给予自噬抑制剂3-MA干预NRK-52E细胞后,Western blotting结果及定量RT-PCR结果显示,与HG组相比,3-MA可抑制Beclin-1和LC3的表达（P＜0.05）,而P62表达升高（P＜0.05）,MCP-1、IL-1β、乙酰化NF-κB p65表达升高（P＜0.05）,FN、α-SMA表达升高（P＜0.05）。第二部分:（1）免疫荧光结果显示,SIRT1呈点状散在表达于肾小管上皮细胞胞浆和胞核中,HG组SIRT1荧光强度较N组减弱（P＜0.05）,HG+R组较HG组增强（P＜0.05）,HG+Ex-527组荧光强度较HG组下降（P＜0.05）。（2）给予白藜芦醇干预后,Western blotting及定量RT-PCR结果显示,与HG组相比,NRK-52E细胞SIRT1表达增强（P＜0.05）,Beclin-1和LC3表达增强（P＜0.05）,P62表达减低（P＜0.05）,MCP-1、IL-1β、乙酰化NF-κB p65表达减低（P＜0.05）,FN、α-SMA表达减低（P＜0.05）。（3）给予Ex-527干预后,Western blotting及定量RT-PCR结果显示,与HG组相比,Ex-527可抑制SIRT1的表达（P＜0.05）,Beclin-1和LC3表达减低（P＜0.05）,P62表达增多（P＜0.05）,MCP-1、IL-1β、乙酰化NF-κB p65表达增多（P＜0.05）,FN、α-SMA表达增多（P＜0.05）。第三部分:中药黄芪治疗DN的核心活性成分为黄芪甲苷Ⅳ、槲皮素、山柰酚、毛蕊异黄酮、刺芒柄花素、异鼠李素等,核心靶点有PTGS2、IL6、AKT1、RELA、CDKN1A、TP53等,涉及的关键信号通路有PI3K-Akt、HIF-1、FOXO、JAK-STAT、P53信号通路等,其功能主要涉及凋亡信号通路、DNA结合转录因子活性的调节、炎症反应、细胞死亡正向调控、上皮细胞增殖、活性氧代谢过程、细胞粘附调节等生物学过程。分子对接验证显示,与本课题相关的靶基因RELA（NF-κB p65）、IL1B、NFKBIA以及与NF-κB信号通路相关的靶基因IKBKB,与黄芪有效活性成分黄芪甲苷Ⅳ均结合活性较好。第四部分:（1）高糖培养条件下,给予15ug/ml AS-Ⅳ和SIRT1激活剂干预NRK-52E细胞,培养24小时,细胞免疫荧光检测显示,HG+R组和HG+AS-Ⅳ组SIRT1荧光强度较HG组增强。定量结果表明,HG+R组、HG+AS-Ⅳ组SIRT1表达较HG组上升（P＜0.05）,HG+R组和HG+AS-Ⅳ组表达无统计学差异（P＞0.05）。（2）Western blotting及定量RT-PCR结果显示,与HG组相比,HG+R组、HG+AS-Ⅳ组NRK-52E细胞SIRT1表达升高（P＜0.05）,Beclin-1和LC3表达增强（P＜0.05）,P62表达下降（P＜0.05）,MCP-1、IL-1β、乙酰化NF-κB p65表达降低（P＜0.05）,FN、α-SMA表达降低（P＜0.05）。第五部分:（1）各组大鼠一般情况:N组大鼠毛发整齐、光泽度好,反应敏捷,进食、进水及大小便未见异常。DN组大鼠毛发逐渐脱落、稀疏、无光泽,活动度减弱,反应力下降,饮食、饮水量增多,尿量增加,粪便相比N组较干燥,逐渐出现消瘦,精神状态差。R组及AS-Ⅳ组大鼠活动、反应、精神状态均较DN组表现良好,与N组相比仍较差,尿量较前减少。（2）生化指标:DN组、R组、AS-Ⅳ组大鼠尾静脉随机GLU均＞16.7mmol/L,与N组相比差异有统计学意义（P＜0.05）;随着干预周期的延长,DN组大鼠GLU进一步升高;R组及AS-Ⅳ组GLU均高于N组（P＜0.05）,8周末与DN组相比GLU水平降低（P＜0.05）。DN组、R组及AS-Ⅳ组大鼠24UTP明显高于N组（P＜0.05）;8周末时,DN组大鼠24UTP较N组增加（P＜0.05）;R组及AS-Ⅳ组与DN组相比下降（P＜0.05）。4周末、8周末DN组大鼠BUN、Scr水平较N组升高（P＜0.05）,经AS-IV及白藜芦醇干预后较DN组有所下降（P＜0.05）。（3）各组大鼠肾脏组织HE、PAS、PASM及Masson染色结果显示:N组大鼠肾小管上皮细胞大小一致,排列整齐,系膜及基底膜结构正常,Masson染色很少见蓝染胶原组织。与N组比较,DN组大鼠肾组织基底膜增厚,系膜细胞和系膜基质增生,肾小管上皮细胞肥大,肾小球系膜区及肾小管上皮细胞内可见PAS阳性蛋白沉积,Masson染色见蓝染胶原组织;但未见肾间质纤维化。经黄芪甲苷及白藜芦醇干预后,肾脏病理改变有不同程度地减轻,PAS阳性蛋白沉积减少,蓝染胶原组织减少。（4）各组大鼠肾脏组织免疫组化结果显示:SIRT1呈棕色颗粒表达于肾小管的细胞核、胞质,N组大鼠肾组织有一定量SIRT1表达,DN组大鼠SIRT1表达较N组下降（P＜0.05）,R组及AS-Ⅳ组与DN组相比表达升高（P＜0.05）。乙酰化NF-κB p65蛋白呈棕色弥散表达于肾小管的胞核和胞质,N组大鼠肾组织有少量表达,DN组大鼠乙酰化NF-κB p65表达较N组升高（P＜0.05）,R组及AS-Ⅳ组与DN组相比表达下降（P＜0.05）。Beclin-1、LC3呈棕色颗粒主要表达于胞质,DN组大鼠Beclin-1、LC3表达较N组下降（P＜0.05）,R组及AS-Ⅳ组与DN组相比表达升高（P＜0.05）。MCP-1、IL-1β呈棕色颗粒表达于细胞核和胞质,DN组大鼠MCP-1、IL-1β表达较N组升高（P＜0.05）,R组及AS-Ⅳ组与DN组相比表达降低（P＜0.05）。FN、α-SMA呈棕褐色颗粒表达于细胞核和胞质,DN组大鼠FN、α-SMA表达较N组升高（P＜0.05）,R组及AS-Ⅳ组与DN组相比表达降低（P＜0.05）。（5）各组大鼠肾脏组织Western blotting和定量RT-PCR结果显示:与N组相比,DN组肾组织SIRT1、Beclin-1、LC3蛋白和m RNA表达下降（P＜0.05）,P62表达升高（P＜0.05）,乙酰化NF-κB p65、MCP-1、IL-1β表达升高（P＜0.05）,FN、α-SMA表达升高（P＜0.05）;AS-Ⅳ组及R组与DN组相比,肾组织中SIRT1、Beclin-1、LC3的蛋白和m RNA表达增强（P＜0.05）,P62表达减低（P＜0.05）,乙酰化NF-κB p65、MCP-1、IL-1β表达减低（P＜0.05）,FN、α-SMA表达减低（P＜0.05）。结论:高糖干预可抑制肾小管上皮细胞的自噬活性,诱导促炎因子及上皮-间充质转化指标的表达,其机制与抑制SIRT1表达,调控SIRT1/NF-κB信号通路,调节自噬及炎症有关。基于网络药理学分析结果示,黄芪甲苷Ⅳ为黄芪治疗糖尿病肾病的有效成分,NF-κB p65、IL1B为黄芪甲苷治疗糖尿病肾病的关键靶点。体内及体外研究表明,黄芪甲苷能够通过调控SIRT1/NF-κB信号通路,增强自噬,抑制炎症,从而改善高糖条件下NRK-52E细胞上皮-间充质转化,改善糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化。