本论文以桂竹香幼叶总RNA为起始材料，构建了桂竹香苗期幼叶的cDNA文库，文库滴度为6.2×10~5pfu／ml；并以菜豆的外膜蛋白基因cDNA部分序列为探针，从桂竹香幼叶的cDNA文库中筛选到桂竹香的外膜蛋白基因cDNA克隆并作了分析。取得了以下研究结果： 1．桂竹香苗期幼叶cDNA文库的建立 将桂竹香幼叶组织在加入4M异硫氰酸胍变性液中匀浆后，依次加入乙酸钠（pH4.0），10ml水饱和酚，2ml氯仿／异戊醇（49:1），将混合液转入离心管中离心，取上清，该上清中包含有总RNA。这就是用一步法将总RNA从蛋白质和DNA中分离出来。在上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀2h，4℃ 10000g离心20min，收集沉淀，用预冷的70％的乙醇洗涤，晾干后，溶于300ul用DEPC处理过的双蒸水中。此为总RNA，于-70℃保存。 本论文在建立桂竹香的幼叶cDNA文库时，采用的SMART技术是Clontech公司推出的。它是利用mRNA 5’帽的结构特点，合成一段Oligo作为CapSwitch，在oligo（dT）引导逆转录后作PCR反应的5’引物。全长的ds cDNA的合成使用了LD-PCR方法。该方法不仅能得到完整的cDNA，并且在cDNA的两端引入了sfiⅠ酶切位点，有利于cDNA定向捅入。当cDNA与载体TriplEx2TM连接用包装蛋白包装后，该文库于-70℃冰箱中保存。 2．桂竹香幼叶cDNA文库质量检测 所得的桂IJJ.香幼叶的cDNA文库用XL一blue铺板进行检测。所铺的平板中 加有lP丁G和x一ga!，测得桂竹香苗期幼l琦’cDNA文库的滴度为:6.2又10，p倒1111。 在平板上得到的蓝斑数分别为15（稀释比例为:l:10）、l}（稀释比例为:l: 】5）和1（稀释比例为:1:20）。经计算其重组率约为85%。 按常规方法扩增文库，并测其扩增文库的滴度为:1 .2又l护。将扩增后的 文库于一700C保存。 从平板上随机挑取7个噬菌体克隆，提取质粒，电泳检测，其中有4个 克隆含有重组子，其插入片‘段介于500[，P一!kb之间，有2个克隆的插入片段大 一于750bp，另有2个小于750bp。 3.桂竹香幼川·cDNA文库中筛选外膜蛋白基因cDNA克隆;t分析 使用实验室保存的菜豆的外膜蛋自基因的cDNA序列为探钊，采用l。- 抢Pldc仰随机引物标记法标记该探全卜。按常规的噬菌休文库筛选方法进行杂 交筛选，初筛获得6个阳性克隆，复筛后经PCR分析和酶切分析，有4个克 隆有插入片段，将这4个克隆送出测序。测序结果表明获得了一段长为520bp 的核营酸序列。将该序列与GenBal:k和Blast rnail Serve:r千，己报道的序列进行 同源性比较。从而确定得到了桂竹香外膜蛋白基因的。DN八。起始密码了从第 44bp开始，存在一个山259个核首酸组成的开放阅读框，共编码71个氨基酸 残基。对氨基酸序列进行同源性分析，发现它与拟南并、菜豆的外膜蛋自的氨 基酸序列的同源性分别为51%、47%:与菠菜叶绿体6.7kDa外膜蛋白氨基酸 序列的同源性为43%;与菜豆!11绿休】4kDa外膜蛋自氨基酸序列的同源性为 53%。该基因已在GellBallk生:登录，其登录号为AF367436。该基因的CDNA 已向中华人民共和国国家知识产权局中请专利，专利号为01 106407.2。