小麦赤霉病生防菌的筛选及Frenolicin B抗病活性研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:tushudasha
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小麦(Triticum aestivum L.)是人类最主要的粮食作物之一,由镰刀菌引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是一种危害严重的世界性真菌病害,由于近年来气候和种植方式的变化,小麦赤霉病已大规模流行与爆发,对全球小麦种植和食品安全构成了严重威胁。由于抗病种质资源缺乏,目前仍以化学防治为主要措施,但长期大量使用化学药剂会出现严重的抗药性问题。而生物防治对环境更加友好、不易产生抗药性,且资源丰富,运用微生物资源或其代谢产物进行生物防治已成为绿色农业理念下的主要趋势。本研究使用6种分离培养基从小麦生境中分离放线菌,通过体外拮抗试验以及离体抗病试验筛选小麦赤霉病高效生防菌株,测定生防菌株发酵液活性,结合全基因组序列的次级代谢产物预测结果以及对活性化合物的分离纯化,确定生防菌的主要活性代谢产物,并进一步探索活性化合物的活性、田间防效以及抑菌机制。主要研究结果如下:(1)从安徽和河南两省田间采集小麦样品,共分离得到827株放线菌,其中链霉菌占主要部分,对分离自不同样品不同位置的放线菌丰度和菌种数进行统计分析比较,发现染病小麦的根际土、根内和穗内的放线菌菌种多样性以及根际土和穗内的菌群丰度明显高于健康组样品,而根内菌群丰度低于健康组。同时根际土的菌群丰度和菌种数都远大于内生菌,且病小麦的根际土中菌种多样性和菌群丰度都是最高的,而穗内的菌群丰度和菌种数都远小于根际土和根内。(2)从小麦生境分离出10株特异放线菌,通过多相分类鉴定分别为链霉菌属(4株)、姜氏菌属(1株)、小双孢菌属(3株)、球单孢菌属(1株)、假诺卡氏菌属(1株)的新种放线菌,其中6株分离自染病小麦的根际土,且有4株为链霉菌,生防菌NEAU-H2为其中一株新种链霉菌。(3)通过对禾谷镰刀菌PH-1的体外拮抗试验筛选出104株活性菌,选取其中活性大于50%的20株菌为拮抗菌进行体内抗病试验,根据体外和体内活性测试结果,以及20株菌间形态差异和进化距离远近,选择活性最好且与其他菌株差异较大的两株菌—NEAU-H3和NEAU-H17进行后续研究。(4)生防菌NEAU-H3对禾谷镰刀菌PH-1具有很强的拮抗作用,且抑菌谱广,同时具有纤维素降解、木质素降解、产生吲哚乙酸等多种活性,其无菌发酵液对赤霉病菌具有很好的生防效果,是一株潜在的可能产生新型抗真菌化合物的高效生防菌株。(5)根据全基因组次及代谢产物基因簇分析,以及活性代谢产物的分离纯化,最终确定生防菌NEAU-H3的主要活性代谢产物为吡喃萘醌类化合物Frenolicin B。(6)Frenolicin B对禾谷镰刀菌PH-1具有强烈的抑制活性,并在大田试验中表现出良好的抗赤霉病防效。经过有效抑制中浓度的测定,Frenolicin B对禾谷镰刀菌以及多种植物病原真菌均表现出强烈的抑制作用,具有广谱抑菌活性,且根据交互抗性试验结果,Frenolicin B与赤霉病常用杀菌剂多菌灵之间并无交互抗性,且并无该抗生素抑制镰刀菌相关的报道,是一种新型抗赤霉病药剂。(7)电镜观察发现,禾谷镰刀菌PH-1经Frenolicin B处理后,菌丝呈现出粗细不均匀、肿胀、扭曲的状态,且内部结构发生明显的变化,细胞质固缩,密度发生改变。(8)为进一步探究其抑菌机制,对经Frenolicin B处理后的禾谷镰刀菌PH-1菌丝进行转录组测序分析,发现PH-1在经Frenolicin B处理后,有2,520个基因表达出现显著差异,其中磷酸酶、能量代谢相关基因显著下调,而与应激反应、核酸修复相关的基因显著上调。根据KEGG通路和GO条目的GSEA富集分析,发现Frenolicin B显著抑制了PH-1多种代谢过程,其中核苷酸代谢以及能量代谢是Frenolicin B的主要目标。(9)对生防菌株NEAU-H17的活性代谢产物进行分离纯化,经鉴定其主要活性代谢产物为阿扎霉素类似物:2-Demethylazalomycins F4a、2-Demethylazalomycins F5a,已广泛用于植物病虫害防治以及医药领域的研究中,在本研究中,该化合物对F.graminearum的菌丝生长表现出强烈的抑制作用,具备开发成防治小麦赤霉病农用抗生素的潜力。
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