胃癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一,江苏省胃癌的发病率和死亡率明显高于全国水平。尽管治疗手段及水平不断提高,但治疗效果尚不理想,寻找新的胃癌预后指标和探索新的治疗思路是十分紧迫的科学命题。胃癌复发与转移是胃癌治疗失败的主要原因,对于肿瘤微环境的深入研究是提高胃癌5年生存率的重要途径。有效的肿瘤免疫应答,除提供第一信号外,还需要协同刺激分子参与并提供辅助的第二信号,才能使T细胞达到生理活化阈值。适宜的协同刺激信号可以降低T细胞活化时对第一信号的需求,而抑制性的协同刺激信号可以减弱免疫应答或导致免疫耐受。协同刺激分子B7-H4是B7家族中的一个新成员,主要表达在巨噬细胞、成熟的树突状细胞和某些肿瘤细胞以及活化的T细胞上,它可通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期负性调控T细胞的免疫应答,并在介导肿瘤免疫应答过程中发挥重要作用,肿瘤细胞表达的B7-H4可能参与了肿瘤的形成与进展。因此,干预协同刺激分子B7-H4将成为胃癌治疗的新策略。细胞因子激活的杀伤细胞(Cytokine-induced Killer Cells, CIK)是一类能调节和增强机体免疫功能的新型抗肿瘤效应细胞,作为治疗性免疫细胞业已在临床广泛应用,但治疗性细胞进入机体后必然受到肿瘤微环境的影响,而负性协同刺激分子的表达与CIK细胞治疗是否存在关联至今尚未明了。本文首先探讨了协同刺激分子B7-H4在胃癌肿瘤组织中的表达对胃癌预后的关系,分析了B7-H4在胃癌表达的临床意义,并进一步研究了B7-H4在胃癌肿瘤组织中的不同表达及对胃癌患者采用CIK细胞免疫治疗效果的影响,确立了CIK细胞临床治疗的纳入标准,为深入探索干预协同刺激分子B7-H4在胃癌综合治疗中的可能作用机制奠定了基础。第一部分协同刺激分子B7-H4在胃癌组织中表达及其与预后的关系【目的】检测胃癌组织中协同刺激分子B7-H4的表达,探讨协同刺激分子B7-H4的表达与胃癌临床病理因素及患者生存时间与预后的关系。【方法】应用免疫组织化学染色,检测156例胃癌患者手术标本中B7-H4的表达;应用生物技术,体外诱导自体细胞因子激活的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells, CIK)进行免疫治疗胃癌。【结果】B7-H4在胃癌组织中阳性表达率为44.9%;单因素分析显示,B7-H4的表达与性别、年龄、组织学类型、病理分级、肿瘤大小等均无明显相关;但浸润深度和淋巴结转移与B7-H4阳性表达显著关联,侵入肌层组的B7-H4阳性率高于未侵入组(49.1% vs 16.7%),差异有统计学意义(χ~2=8.467,P=0.004),淋巴结转移组B7-H4阳性率高于未转移组(χ~2=17.339,P<0.0001)。与B7-H4高表达组相比较,B7-H4低表达组胃癌患者中位生存时间显著延长13个月,差异有统计学意义(χ~2=12.38,P<0.0001)。多因素COX模型分析显示,与B7-H4低表达组比较,B7-H4高表达组胃癌患者的死亡风险明显增加(RR=1.85,95%CI=1.15~2.96);CIK治疗组与化疗组相比,CIK治疗组胃癌患者的死亡风险明显降低(RR=0.53,95%CI=0.33~0.85)。【结论】B7-H4的高表达与胃癌患者的生存时间成负相关,证实了B7-H4为一负性调节分子,可作为判断胃癌生存期的指标;CIK细胞治疗可以显著延长胃癌患者的生存期。第二部分实时荧光定量PCR检测B7-H4基因表达方法的优化【目的】建立实时荧光定量PCR检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法。【方法】采用自行设计的检测协同刺激分子B7-H4及内参照基因GAPDH的引物及TaqMan探针,经优化反应体系及反应条件后,用于检测B7-H4及GAPDH的基因表达水平。将B7-H4和内参照基因GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确并纯化后分别与pMD19-T载体连接,分别克隆构建含B7-H4及GAPDH基因片段的重组质粒,作为实时荧光定量PCR检测B7-H4及GAPDH基因表达的标准品。将重组质粒标准品进行定量及梯度稀释,建立标准曲线。【结果】PCR扩增产物分别经测序证实为B7-H4及GAPDH基因的特异性片段。该法检测B7-H4基因表达的灵敏度为527copies/ml,线性范围为5.27×102~5.27×107copies/ml,标准曲线方程为:Y=-3.1395X+41.805,直线回归相关系数r=0.995,批间变异系数范围为2.39%~3.59%,扩增效率108.2%。该法检测GAPDH基因表达的灵敏度为386copies/ml,线性范围为3.86×102~3.86×107 copies/ml,标准曲线方程为:Y=-3.2436X+41.083,直线回归相关系数r=0.999,批间变异系数范围为2.26%~3.86%,扩增效率103.4%。【结论】成功构建了实时荧光定量PCR检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法,该方法具有较好的特异性、很高的灵敏度和良好的重复性。第三部分协同刺激分子B7-H4表达对细胞因子激活的杀伤细胞治疗胃癌患者生存时间的影响【目的】研究协同刺激分子B7-H4在胃癌组织中的不同表达水平对CIK细胞治疗胃癌患者生存时间的影响,为胃癌的诊断与治疗提供新策略。【方法】应用生物技术体外诱导自体细胞因子激活的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells, CIK)进行临床应用。采用回顾性队列研究,对156例胃癌患者组织进行B7-H4免疫组化评估;并比较B7-H4在胃癌组织中的表达水平对化学治疗组与化学治疗联合CIK细胞治疗组治疗效果的影响。【结果】单纯化学治疗组中,B7-H4低表达病人的中位生存时间明显高于B7-H4高表达病人(38 vs 16),差异有统计学意义(χ~2=13.99,P<0.0001);化学治疗联合CIK治疗组中,B7-H4低表达病人的中位生存时间明显高于B7-H4高表达患者(55 vs 34),差异有统计学意义(χ~2=4.679,P<0.05);在B7-H4高表达组中,CIK组中位生存时间比化学治疗组延长了18个月,在B7-H4低表达组中,CIK组中位生存时间比化学治疗组则延长了17个月。在调整了年龄、性别、肿瘤发生部位等混杂因素后,与B7-H4低表达相比B7-H4高表达组病例的死亡风险明显增加(RR=1.73,95%CI=1.09~2.76)。【结论】协同刺激分子B7-H4的高表达使胃癌患者的死亡风险明显增加,CIK细胞的治疗可有效控制和干预B7-H4的表达并延长胃癌患者的中位生存时间。第四部分CIK细胞治疗胃癌与其生存时间相依多因素分析的研究【目的】探讨采用细胞因子诱导的杀伤细胞过继免疫治疗胃癌与其生存时间相依多因素的相关性。【方法】用生物技术诱导培养后的CIK细胞回输给胃癌病人;采用回顾性队列研究,用Kaplan-Meier估计中位生存时间和生存率,Log-rank检验比较临床因素对生存率的影响,拟合多因素COX模型,用RR及95%CI估计CIK细胞治疗与死亡结局和生存时间的联系强度。【结果】在化疗组和CIK治疗组之间的均衡性分析,差异无统计学意义(P>0.05)。CIK治疗组的复发率明显低于化疗组(53.3% vs 71.6%),差异有统计学意义(χ~2=5.566,P=0.018)。CIK治疗组胃癌病人的中位生存时间(月)明显高于化疗组(49 vs 27),差异有统计学意义(χ~2=10.907,P=0.001)。并随着CIK治疗次数的增加,四组生存率曲线差异有统计学意义(χ~2=14.534,P=0.002)。CIK治疗组的2年生存率明显高于化疗组(P<0.05)。在调整了年龄、性别、肿瘤分期、浸润深度混杂因素后,与化疗组相比,CIK细胞治疗胃癌的死亡风险明显降低(RR=0.52,95%CI=0.34-0.82),并随着CIK细胞治疗次数的增加,胃癌病人的死亡风险逐步降低(趋势检验,P=0.0001),与化疗组相比,CIK治疗次数超过25次以上的胃癌患者,RR=0.14,95%CI=0.03-1.58。CIK治疗次数与生存时间小于36个月的胃癌患者的死亡风险呈显著负相关(RR=0.54,95%CI=0.36-0.80)。另外,随着肿瘤分期、复发及年龄的增加能显著提高胃癌患者的死亡危险(RR=28.87,95%CI:7.05-118.25;RR=2.10,95%CI:1.40-3.11;RR=1.66,95%CI:1.12-2.46)。【结论】用CIK细胞治疗胃癌可降低患者的死亡风险,并显著地提高了胃癌患者的生存期。第五部分协同刺激分子B7-H4影响细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胃癌预后的多因素COX模型分析【目的】评价协同刺激分子B7-H4表达对细胞因子诱导的杀伤细胞过继免疫治疗胃癌患者后预后的影响。探讨协同刺激分子B7-H4的表达与胃癌的关系,并分析B7-H4在胃癌组织中的不同表达水平对细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胃癌患者的复发和死亡的风险。【方法】采用回顾性队列分析156例胃癌的临床资料,并按其治疗情况分为化疗组(81例)和CIK联合治疗组(75例)。对胃癌患者组织进行B7-H4免疫组织化学染色,并比较B7-H4不同表达情况下,化疗组与CIK联合组治疗后无瘤生存率。【结果】化疗组和CIK联合组间各临床病理资料的差异无统计学意义(P>0.05)。两组术后中位无瘤生存时间分别为18.0(95%CI:10.5~25.5)个月和45.0(95%CI:19.5~70.5)个月,差异有统计学意义(χ~2=11.631,P=0.001)。两组术后中位生存时间分别为27.0(95%CI:19.6~34.4)个月和49.0(95%CI:35.9~62.1)个月,差异有统计学意义(χ~2=10.907,P=0.001)。86例B7-H4低表达者中,采用单纯化疗和CIK联合治疗后中位无瘤生存时间分别为32.0(95%CI:26.5~37.5)个月和62.0(95%CI:23.0~101.0)个月,差异有统计学意义(χ~2=4.663,P=0.03)。70例B7-H4高表达者中,采用单纯化疗和CIK联合治疗后中位无瘤生存时间分别11.0(95%CI: 3.2~18.8)个月和18.0(95%CI: 7.3~28.7)个月,差异有统计学意义(χ~2=11.971,P=0.001)。胃癌组织B7-H4高表达组与B7-H4低表达组比较,患者中位无瘤生存时间(月)及95%CI分别为16(11.9-20.1)和47(22.4-71.6),中位生存时间(月)及95%CI分别为25(19.0-31.1)和43(35.2-50.8)。在化学治疗组中,B7-H4低表达患者的中位生存时间明显高于B7-H4高表达患者(36 vs 16),差异有统计学意义(χ~2=14.14,P<0.0001)。在化疗联合CIK治疗组中,B7-H4低表达患者的中位生存时间有高于B7-H4高表达患者的趋势(55 vs 34),但差异无统计学意义(χ~2=1.78,P=0.182)。在化学治疗组中,B7-H4低表达患者中位无瘤生存时间高于B7-H4高表达(33 vs 11),差异有统计学意义(χ~2=18.956,P<0.0001)。在化疗联合CIK细胞治疗组中,B7-H4低表达患者中位无瘤生存时间显著高于高表达组(90 vs 18),差异有统计学意义(χ~2=3.842,P=0.050)。在调整了性别、年龄等混杂因素后,与B7-H4低表达比较,B7-H4高表达组病例的复发和死亡风险明显增加(RR=2.30,95%CI=1.41~3.75;RR=1.90,95%CI=1.20~3.01)。【结论】B7-H4高表达可能是提高胃癌复发和死亡风险的独立危险因素。采用CIK细胞回输治疗可控制和干预B7-H4的表达并延长胃癌患者的中位生存时间,胃癌B7-H4低表达可作为CIK细胞治疗的纳入标准。综上所述,本文通过分析协同刺激分子B7-H4在胃癌组织中的表达及其临床意义及其与CIK细胞治疗的可能关联性,发现:1)协同刺激分子B7-H4在胃癌组织中高表达与胃癌患者的生存时间呈负相关,B7-H4分子可作为判断胃癌生存期的指标;2)B7-H4高表达可能是提高胃癌复发和死亡风险的独立危险因素;3)协同刺激分子B7-H4在胃癌组织中的不同表达水平与细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胃癌患者的复发和死亡的风险相关,采用治疗性CIK细胞回输治疗可干预B7-H4的表达并延长胃癌患者的中位生存时间;4)胃癌B7-H4低表达可作为CIK细胞治疗的纳入标准。这些为寻找胃癌生物治疗、胃癌诊断的生物学指标及设计有效的胃癌免疫干预手段提供了新的理论基础,具有原创性和临床实用价值。