猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)是引起猪传染性胃肠炎(TGE)的主要病原。该病是一种急性、高度接触性肠道传染病,在临床上以呕吐、严重腹泻、脱水以及2周龄内仔猪高死亡率为主要特征。目前对TGEV全基因组序列、结构及主要蛋白的功能己有较深入的了解,但有关TGEV感染引起猪的免疫机理及发病机制尚不了解,阻碍了新型疫苗和特异药物的研发。因此,加大对TGE病原的免疫致病机制的研究是TGE防控工作中的重点。本文比较研究了TGEV对猪睾丸(ST)细胞和成熟树突状细胞(m DC)的感染特性,并对猪信号转导与转录激活子(STAT1)基因进行了克隆测序、分子进化分析和体外真核表达,分析了TGEV感染后宿主细胞中STAT1的动态表达情况;同时还研究了IFN-α体外抗TGEV复制情况、TGEV感染宿主细胞后IFN-α的产生情况以及TGEV感染对IFN-α信号通路中相关抗病毒基因表达的影响,以期了解IFN-α在TGEV与宿主细胞相互作用中的免疫调控功能。具体研究内容如下:1.分离健康仔猪外周血淋巴细胞,应用贴壁法分离DC,rh GM-CSF及rh IL-4刺激DC成熟,电子显微镜下观察成熟DC的形态。TGEV分别感染ST细胞和m DC,感染后不同时间分别收获培养上清液和细胞,TCID50测定培养上清液中TGEV滴度,绘制病毒生长曲线;Real-time PCR检测细胞中TGEV含量。结果显示TGEV在ST和m DC中都可以增殖,且增殖趋势一致,均在感染后3h开始增殖,24h开始大量增殖,48h达到高峰,然后开始下降,但是TGEV在ST细胞中的病毒滴度远远大于DC中的。2.参照NCBI中其它种属的STAT1基因设计合成引物,从ST细胞中提取RNA,反转录c DNA后,PCR扩增猪的全长STAT1基因,克隆鉴定后进行序列测定及分析。将测序正确的重组质粒用Xhol和Bam HI进行双酶切,分离纯化目的基因,与经同样双酶切纯化的载体p EGFP-N1连接,构建了重组真核表达质粒,经酶切、测序鉴定后将构建的重组质粒用脂质体转染至ST细胞,Western blot检测STAT1蛋白的表达情况。同时将TGEV感染ST细胞,应用荧光定量PCR检测接毒不同时间STAT1在ST细胞中的表达情况。结果表明猪STAT1基因大小为2 274 bp,在进化上相对保守;构建了猪源STAT1基因的重组真核表达质粒p EGFP-STAT1,转染ST细胞后,Western blot检测到特异性的目的蛋白,说明p EGFP-STAT1在ST细胞中成功表达。TGEV感染ST细胞后STAT1 m RNA的表达量在6h开始表达,低表达一直持续到12 h,在24 h时开始升高,为对照的6.8倍,达到高峰。该试验为下一步研究TGEV是否影响I型干扰素信号通路中STAT1蛋白入核奠定了基础。3.为了解IFN-α体外抗TGEV复制的情况,将不同浓度的IFN-α(10 000、1 000、100、10、1和0 IU/m L)预处理ST细胞12h后,TGEV感染ST细胞,待阳性对照出现100%细胞病变,收集各组样品后提取RNA,荧光定量PCR检测各试验组TGEV含量。结果显示TGEV在ST细胞中的含量随干扰素浓度的上升而下降。说明干扰素对TGEV的复制有较强的抑制作用。4.为了研究TGEV感染对干扰素产生及其相关基因表达的影响,将TGEV分别感染ST细胞和DC,分别于感染后3、6、12、24和48 h,收集细胞,Real-time PCR测定TGEV感染后宿主细胞表达IFN-α的情况,以及IFN-α信号通路中各抗病毒相关基因表达情况。结果表明TGEV感染ST细胞和DC后,宿主细胞可以大量表达IFN-α,且DC在感染3h就高表达IFN-α,显示DC在抗TGEV感染的早期免疫反应中起着重要作用;TGEV感染ST细胞和DC后均可以引起IFN-α信号通路中相关抗病毒细胞因子的表达上调,说明TGEV感染产生的IFN-α在一定程度上能起到抗病毒作用。