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研究背景:心力衰竭是心脏泵功能障碍,以致心输出量减少到不足以适应全身组织代谢需要的一种病理过程,常伴随着适应不良性心肌肥厚、心肌纤维化和心肌细胞凋亡等。近年来,利用高通量RNA测序技术已证实多种非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）在心衰过程中发生显著的差异表达变化。微小RNA（micro RNA,miRNA）是nc RNA中研究比较广泛的一类小分子RNA。既往文献报道miRNA主要通过与靶基因的3’非翻译区（UTR）区来结合抑制靶基因的蛋白表达。近年来有研究者分别对不同类型细胞的细胞核/质RNA进行分离和测序,发现细胞核中存在大量高表达的miRNA,目前对这些miRNA的功能仍然不十分清楚。本文将研究心肌成纤维细胞胞核内miRNA对心肌纤维化的调控作用和可能机制。研究目的:1.明确胞核内miR-199b-5p对心肌纤维化的调控作用;2.阐明胞核内miR-199b-5p调控心肌纤维化的分子机制。研究方法:1.探究miR-199b-5p在心肌纤维化过程中的表达1.1 Masson染色和Western-blot检测心衰病人及健康对照者心肌组织纤维化程度和纤维化相关基因表达;1.2 miRNA表达谱芯片检测心衰病人及健康对照者心肌组织中miRNA的差异表达,RT-q PCR验证差异表达miRNA并鉴定其核质分布;1.3原代分离并培养人心房肌成纤维细胞（Human atrial fibroblast,HAFs）,利用免疫荧光法鉴定HAFs中ACTA2的表达;1.4血管紧张素II（Angiotensin II,Ang-II）处理HAFs,RT-q PCR和Western-blot分别检测miR-199b-5p和纤维化相关基因的表达,通过FISH实验及RT-q PCR检测AngII对HAFs中miR-199b-5p核质定位改变的影响;1.5原代分离培养乳小鼠成纤维细胞（Neonatal mouse atrial myofibroblasts,m CFs）,并通过α-SMA免疫荧光法对其进行鉴定;1.6 Ang-II处理m CFs,RT-q PCR和Western-blot分别检测miR-199b-5p和纤维化相关基因表达,FISH实验及RT-q PCR检测Ang-II对m CFs中miR-199b-5p核质定位的影响。2.探究胞核内miR-199b-5p对心肌成纤维细胞纤维化表型的影响2.1在HAFs和m CFs中分别转染miR-199b-5p mimic,通过Ed U、流式细胞术及Trans-well实验检测其对细胞增殖、迁移的影响;2.2在HAFs和m CFs中分别转染miR-199b-5p mimic,Western-blot检测其对纤维化相关基因表达的影响,FISH实验检测miR-199b-5p转染后在核质中的分布。3.探究胞核内miR-199b-5p调控心肌纤维化的分子机制3.1 UCSC数据浏览显示miR-199b基因座存在较强的增强子组蛋白修饰标记H3K27ac,H3K4me1的水平;3.2 ChIP-qPCR检测miR-199b基因座增强子组蛋白修饰标记H3K27ac,H3K4me1的水平;3.3重组腺病毒介导m CFs上调表达CDK9,利用Ed U、流式细胞术及Trans-well实验检测其对细胞增殖、迁移的影响;3.4重组腺病毒介导m CFs上调表达CDK9,Western-blot检测其对纤维化相关基因表达的影响,并进一步通过免疫荧光及Western-blot检测CDK9及p-Smad3核定位变化;3.5双荧光素酶报告基因实验检测miR-199b-5p与人及小鼠CDK9启动子区的结合作用;3.6双荧光素酶报告基因实验检测miR-199b-5p与人CDK9 3’UTR区是否有结合作用;3.7分别沉默核转运蛋白IPO8（importin 8,IPO8）和Xpo5（Exportin 5,Xpo5）后,核质分离RT-q PCR检测对miR-199b-5p核质分布的影响。4.探究抑制CDK9表达对逆转miR-199b-5p的促心肌纤维化的作用整体动物水平给予异丙肾上腺素（isoprenaline,ISO）诱导小鼠发生心肌纤维化,在此基础上注射Ago-miR-199b-5p（胆固醇修饰的miR-199b-5p模拟物）,或Ago-miR-199b-5p联合CDK9 si RNA,分别检测整体水平抑制CDK9表达对小鼠整体生存期、心功能和心肌纤维化的影响。研究结果:1.miR-199b-5p在心衰病人心肌及Ang-II诱导心肌纤维化过程中表达升高1.1心衰病人心肌组织中miR-199b-5p表达水平显著升高;1.2 Ang-II处理引起HAFs细胞核内miR-199b-5p水平进一步升高;1.3 Ang-II灌注诱导小鼠心肌纤维化模型中小鼠心肌组织中miR-199b-5p表达水平显著升高;1.4 Ang-II处理可引起m CFs细胞核内miR-199b-5p水平进一步升高。2.miR-199b-5p促进人及小鼠心肌成纤维细胞增殖、迁移及纤维化相关基因表达2.1 miR-199b-5p mimic转染HAFs可引起HAFs的细胞核内miR-199b-5p表达显著升高,并促进细胞增殖、迁移及纤维化相关基因COL1A1、COL3A1、ACTA2/α-SMA表达增加及Smad3信号激活;2.2 miR-199b-5p mimic转染m CFs可引起m CFs的细胞核内miR-199b-5p表达显著升高,并促进细胞增殖、迁移及纤维化相关基因COL1A1、COL3A1、ACTA2/α-SMA表达增加及Smad3信号激活。3.胞核内miR-199b-5p通过促进CDK9介导的Smad3激活促进心肌纤维化3.1 miR-199b基因座位存在增强子组蛋白修饰标记;3.2 miR-199b-5p能够激活临近基因CDK9表达;3.3腺病毒介导过表达CDK9可促进小鼠心肌成纤维细胞增殖、迁移和纤维化相关基因表达;3.4敲减CDK9可抑制小鼠心肌成纤维细胞增殖、迁移和纤维化相关基因表达;3.5 CDK9介导了miR-199b-5p促进纤维化相关基因表达的作用;3.6 miR-199b-5p可特异结合CDK9启动子区并招募pol II来激活CDK9转录表达;3.7胞质中的miR-199b-5p与CDK9 3’UTR无结合作用;3.8核转运蛋白Ipo8可介导miR-199b-5p向核内转移。4.抑制CDK9表达可逆转miR-199b-5p促进心肌纤维化作用4.1给予ISO或ISO结合ago-miR-199b-5p模拟物（胆固醇修饰的miR-199b-5p模拟物）注射治疗的小鼠的总生存期明显少于Sham组,加入Cdk9 si RNA可以显着提高总体生存期;4.2在接受过ago-miR-199b-5p模拟物注射的ISO处理小鼠中观察到射血分数（EF,Ejection fraction）和短轴缩短率（FS,Fraction shortening）的显著降低,但接受过agomiR-199b-5p和Cdk9 si RNA注射的ISO处理小鼠中未观察到EF、FS的降低;4.3在注射了ago-miR-199b-5p模拟物的ISO处理小鼠中发现舒张期末期左心室前壁厚度和收缩末期左心室前壁厚度显著降低,但是注射了ago-miR-199b-5p模拟物的ISO处理小鼠中舒张期末期左心室后壁厚度和收缩期左心室后壁厚度却未见明显降低,左室后壁的改变不明显;4.4天狼星红染色结果显示,miR-199b-5p加剧了ISO诱导的心肌纤维化,这一现象可通过添加Cdk9 si RNA来逆转;4.5蛋白水平检测结果表明,miR-199b-5p增加了COL1A1、COL3A1、α-SMA和CDK9的表达以及Smad3的激活,而在ISO诱导的小鼠尾静脉注射Cdk9 si RNA使纤维化过程发生逆转。研究结论:1.核转运蛋白Ipo8介导了心肌成纤维细胞中miR-199b-5p的转运入核;2.核内miR-199b-5p与CDK9启动子区结合招募pol II来转录激活CDK9;3.核内miR-199b-5p通过激活CDK9/Smad3轴来发挥促进心肌纤维化基因表达的作用。