生物技术、纳米技术、单分子技术相结合的蛋白质纳米通道单分子分析技术已经成为跨学科研究的核心技术之一。以α-溶血素蛋白质七聚体α-HL分子为代表的纳米通道使这一技术在生物、化学、医学等领域得到广泛应用。α-HL蛋白质纳米单通道已在单分子水平上实现了对阳离子、阴离子、有机小分子、DNA、RNA、蛋白质、多肽和聚合物等的检测。尽管蛋白质纳米通道可以检测到单个分子的电流信号,但是这种方法的通量取决于分子到达和穿过纳米孔的频率,只有当响应电流信号积累达到一定数量时才具有统计学意义,这就需要样品达到必要的浓度。介电泳(Dielectrophoresis)是指在非均匀电场中,悬浮在一定介质中的粒子因极化作用在与介质接触的表面诱导出电荷,这些电荷与非均匀电场相互作用导致粒子发生定向的迁移运动。利用介电泳技术已经实现了白血病细胞、肿瘤细胞,活细胞与死细胞,细菌、病毒的分离,同时可以在特定的交流电场与频段下实现分析物的俘获与富集。本文集成两种技术的优势,即蛋白质纳米通道对生物分子的单分子识别能力和介电泳技术可富集小分子的特点,发展了一种新型检测技术:在交变电场下,利用介电泳技术对低浓度分析物(单链DNA,β-环糊精,盐酸金刚烷胺)进行富集,从而达到统计学中纳米通道单分子检测所需的最低浓度;然后利用α-HL蛋白质纳米通道实现分析物单分子检测的目的。该技术操作简便、灵敏度高、检测速度快,为单分子检测和介电泳研究提供了新思路。本文主要研究结果如下:1.在天然纳米单通道(WT)7体系中,利用介电泳/电泳技术富集并检测单链DNA分子。设计特定的单链 DNA 序列(5’-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA AAA GGGTCTGAGGGA-(C)30-3’)作为检测分子。以(WT)7为蛋白质通道,交流电场下筛选介电泳富集的最佳条件,分别为高压低频(15Hz,16 V)和高频低压(100 KHz,10 V或7 V)。最佳条件下介电泳富集单链DNA后,＋120 mV直流电场检测。研究发现,高压低频富集后单链DNA分子穿越纳米通道事件频率增加了 13倍,滞留时间从～0.2 ms增加至～1.0 ms,不同检测电压下,趋势相同。高频低压富集后,事件频率增加了近60倍,滞留时间增加至4.36±0.15ms,最低检测浓度达到6.67x10-12M。介电泳技术对ssDNA实现富集后引起滞留时间增加的现象,为减慢DNA穿越纳米通道的速度提供了新思路,同时给蛋白质纳米通道测序DNA带来了光明前景。2.从α-溶血素突变体(K8A/M113R)7,(M113F)7中筛选与β-环糊精分子键合时间长的蛋白质纳米通道,利用介电泳/电泳技术富集并检测β-环糊精分子。分别采用(K8A/M113R)7和(M113F)7检测β-环糊精分子,结果显示,＋40 mV检测电压下,(K8A/M113R)7对β-羚环糊精分子的键合时间为0.55±0.033 ms;(M113F)7对β-环糊精分子的键合时间为1.21±1.19s。选择突变体蛋白质(M113F)7利用介电泳技术富集β-环糊精分子。以2～5 MHz,0.8 V和1.6 V两个电压条件下富集,结果表明,除3 MHz,0.8 V外,其他条件下,键合次数均增加,最大增加～2倍。介电泳技术对β-环糊精分子的富集在单分子水平上可实现低浓度检测。3.在α-溶血素突变体(M113F)7纳米单通道体系中,β-疹环糊精作为适配体分子,利用介电泳/电泳技术富集并检测盐酸金刚烷胺。以(M113F)7纳米单通道为单分子检测器件,β-环糊精作为适配体分子,检测盐酸金刚烷胺。检测结果显示,随着检测电压从＋40 mV增加至＋100 mV,盐酸金刚烷胺与β-片环糊精分子的作用时间从0.63±0.025 ms减小到0.38±0.013 ms,作用次数从42次减少到20次。采用介电泳技术富集盐酸金刚烷胺,高频低压(1.6 V,1～5 MHz)富集后,＋40 mV检测发现,盐酸金刚烷胺与β-片环糊精分子的作用时间增加了 2～3倍,作用次数增加了～2倍。介电泳技术富集有利于纳米通道对β-CD与1-AdNH2·HCI相互作用的响应。