黄疸是新生儿比较常见的现象,一般不会造成病理损害,但是当血液中胆红素过度升高时就会影响健康并导致一系列的神经功能紊乱,其中听力障碍是最常见的新生儿高胆红素血症后遗症。多中心流行病学调查表明,听神经病与婴幼儿时期发生高胆红素血症有极强的相关性,但胆红素引起听神经病的具体机制还不是很清楚。为了更直观的揭示胆红素对外周听觉器官的毒性作用部位,本研究对体外培养的新生大鼠耳蜗基底膜组织及螺旋神经节进行了胆红素处理,并观察不同浓度的胆红素以及同一浓度不同作用时长下其各个部位毒性效应。第一部分:不同胆红素浓度对大鼠耳蜗组织的损伤效应目的观察不同浓度胆红素对离体培养大鼠耳蜗组织的损伤效应方法健康新生3日龄SD大鼠25只,雌雄不限,分离其双侧的内耳,共得到附带有螺旋神经节的耳蜗基底膜组织50个。体外培养12h后换含5%FBS培养基；取材后48h,倒置显微镜观察,选择状态良好、有成纤维爬出的基底膜40个入选实验,并将其随机分为4组：对照组；实验组：10μmol/L组,50μmol/L组,100μmol/L组,每组各10个标本。分组完毕后开始进行药物处理,试验组每个细胞培养皿中按分组浓度加入胆红素溶液,对照组加入相应体积的生理盐水。所有的标本均在药物处理后24h终止培养并对其进行固定、免疫组织化学染色,共聚焦显微镜观察。结果10μmol/L的胆红素对离体培养的耳蜗组织作用24h时无明显毒性作用,50μmol/L胆红素组中螺旋神经节神经元有明显减少,内外毛细胞形态及数量完整；100μmol/L组中耳蜗组织的螺旋神经节神经元几乎完全消失,内、外毛细胞也都发生了损伤。结论胆红素对耳蜗组织的损伤效应呈浓度依赖性,且胆红素首先损害的部位是螺旋神经节神经元,当药物浓度继续增大时,毛细胞也会受到损伤。第二部分:耳蜗组织受损效应与胆红素作用时同的关系目的观察胆红素对离体培养的新生SD大鼠耳蜗组织损伤的的时间依赖性方法健康新生3日龄SD大鼠35只,雌雄不限,分离每组动物的内耳共得到附带有螺旋神经节的耳蜗组织70个,原代取材培养12h后换含5%FBS培养基；取材后48h,观察组织贴壁、存活良好的60个耳蜗组织入选实验,并将所有组织随机分为六组：24h对照组,24h胆红素组,48h对照组,48h胆红素组,72h对照组,72h胆红素组(每组各10个)；试验组每个细胞培养皿中胆红素终浓度为50μmol/L,对照组加入相应体积的生理盐水。三个试验组分别用药24h、48h、72h终止培养,对照组亦分别在上述时间点取样,并对其进行固定、免疫组织化学染色,之后共聚焦显微镜观察耳蜗组织中毛细胞及螺旋神经节神经元的形态变化并计数、统计对比。结果胆红素作用24h时,离体培养的耳蜗组织中螺旋神经节神经元胞体及其树突纤维即有明显的减少,内外毛细胞形态及数量完整；随着胆红素作用时间的延长,48h时神经元减少更加明显,底回的外毛细胞开始出现缺失；72h时神经元几乎消失殆尽,底回及中回外毛细胞减少明显,底回内毛细胞也发生了数量的减少。同时我们观察到,三个时间点的对照组之间无明显差异。在同样的胆红素作用时长下(24h),当螺旋神经节神经元已经发生明显的数量下降时,内外毛细胞数量缺失不明显,这说明毛细胞与螺旋神经节神经元相比,其对胆红素的毒性相对不敏感；但随着胆红素作用时间的延长(48h及72h),毛细胞也会受到损伤,并且外毛细胞首先出现缺失,内毛细胞相对更能耐受胆红素毒性。结论1.胆红素对螺旋神经节神经元的损伤作用具有时间依赖性；2.螺旋神经节神经元比内外毛细胞对胆红素的毒性作用敏感。第三部分胆红素作用下螺旋神经节神经元caspase-3的表达及其调亡过程观案目的探讨胆红素对螺旋神经节神经元的毒性作用方式方法健康新生3日龄SD大鼠23只,雌雄不限,分离内耳组织共得到附带有螺旋神经节的耳蜗基底膜组织46个,原代取材培养12h后换含5%FBS培养基；取材后48h,观察组织贴壁、存活良好的40个耳蜗组织入选实验,并将所有组织随机分为四组：12h对照组,12h药物组,24h药物组,48h药物组(每组各10个)；分组完毕后开始进行药物处理,试验组每个细胞培养皿中胆红素终浓度为50μml/L,对照组加入相应体积的生理盐水。各组分别在用药12h、18h、36h终止培养,并对其进行固定、免疫组织化学染色、对比,之后共聚焦显微镜观察螺旋神经节神经元中caspase-3的表达情况及胞体形态变化。结果胆红素作用12h时caspase-3高表达,18h时即出现了大量的螺旋神经节神经元胞体的崩解破碎,大量胞体蛋白碎屑残留；36h时,神经元胞体数量明显减少,其树突神经纤维也减少明显,Ⅰ型神经元与Ⅱ型神经元相比减少更甚。结论胆红素能够激活螺旋神经节神经元细胞凋亡程序,引起胞体中caspase-3凋亡蛋白的表达,Ⅰ型神经元与Ⅱ型神经元相比凋亡更明显。