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[目的]1.从行为学的角度探讨联合移植神经干细胞(NSCs)和小胶质细胞对帕金森病(PD)模型大鼠的治疗作用。2.初步研究联合移植NSCs和小胶质细胞改善PD模型大鼠运动功能的分子机制。[方法]1.PD模型制作：取健康成年SD大鼠用立体定向注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制作PD模型。参考大鼠脑立体定位图谱,通过立体定向仪向大鼠右侧脑的前脑内侧束(MFB)和尾壳核(Cpn)注射6-OHDA。术后1周(w)阿朴吗啡(APO)诱导大鼠原地向左侧旋转的行为,多次测量持续旋转大于7/rpm视为成功模型。2. NSCs的培养与鉴定：取SD大鼠胚胎中脑腹侧的组织,解剖显微镜下去除脑膜和血管、剪碎、吹打,制成单细胞悬液加入NSCs无血清培养液培养,待NSCs增殖形成直径约200μm的神经球后传代,传代的NSCs可用于移植。传代的神经球在NSCs分化培养基中继续培养7d后进行GFAP与TH的细胞荧光免疫染色鉴定。3.小胶质细胞培养、分离、纯化与鉴定：取新生24小时(h)内SD大鼠,在解剖显微镜下取出大脑半球皮质,去除脑膜、血管和脉络膜,经胰酶处理后制成单细胞悬液,在含血清的小胶质细胞培养基中混合培养14至21d,采用拍打法和胰酶消化法分离小胶质细胞,差速贴壁法进行纯化,纯化的小胶质细胞进行CD11b细胞免疫荧光染色鉴定,观察小胶质细胞纯度。4.细胞联合移植：将成功的PD模型大鼠随机分为实验组和对照组,实验组将传代的干细胞和纯化的小胶质细胞按7：3比例于损伤原位移植,每个移植孔5μ1(NSCs:3.5×105;小胶质细胞：1.5×105)；对照组移植DMEMF/12,每孔5μl。5.行为学测试：步态调整试验使大鼠躯体悬空,固定后肢和一侧前肢,对侧前肢支撑于桌面上,向前移动大鼠躯干重心,记录10s内着力侧前肢做出调整步伐的次数,在移植后1w、2w、3w比较实验组与对照组的测试结果差异；胡须触碰试验使大鼠躯体悬空,固定后肢和对侧前肢,使大鼠胡须触碰桌沿,同侧前肢支伸出搭上桌沿为1次阳性反应,在移植后1w、2w、3w比较实验组与对照组的阳性表现结果的差异；APO诱导旋转试验比较实验组和对照组PD大鼠各自于移植后1w、2w、3w经APO诱导的旋转速度较术前的改善情况。6.分子生物学检测：实验组和对照组在移植3w后取材,进行酪氨酸羟化酶(TH)的RT-PCR检测和脑组织TH荧光免疫组化染色。[结果]1.接受6-OHDA立体定向注射的SD大鼠共计30只,有21只经APO诱导旋转行为学评估证实成功建立模型,模型成功率70%,随机选取20只分为实验组和对照组,每组10只PD模型大鼠,6只用于行为学检测,4只用于分子生物学检测。2.大鼠胚胎NSCs在体外培养7-11d形成直径200μmo的神经球,细胞免疫荧光试验发现在含血清的分化培养基中培养7d后,神经球与其贴壁长出的凸起中出现GFAP与TH染色阳性的细胞。3.混合培养的小胶质细胞通过拍打法和温和胰酶胰酶消化法分离,差速贴壁的方法纯化后进行CD11b荧光免疫染色,可见95%以上的细胞为阳性。4. NSCs与小胶质细胞在含血清的培养基中进行共培养比单独培养NSCs,TH染色阳性细胞更多。5.与对照组相比,细胞联合移植能增加PD大鼠为适应重心改变而调整前肢的频率(P<0.05);改善PD大鼠悬空状态下,胡须与前肢配合触碰桌沿的行为(P<0.05)；以及改善APO诱导PD大鼠的异常旋转行为(P<0.05)。6. RT-PCR结果显示联合移植1w、2w、3w后,实验组PD大鼠脑组织DA神经元标志基因TH表达比对照组多, 移植3w后荧光免疫组化显示,6-OHDA注射区域脑组织TH染色阳性细胞较对照组增多。[结论]1.胚胎NSCs能够在体外培养,传代后的NSCs可以分化为神经元和神经胶质细胞。NSCs与小胶质细胞联合体外培养能促进NSCs向DA神经元分化。2.在6-OHDA模型大鼠脑内原位联合移植NSCs和小胶质细胞能够改善PD大鼠的运动功能。3.移植后的PD模型大鼠脑内TH表达增多,TH阳性细胞增多,说明联合移植的细胞能够在6-OHDA模型PD大鼠脑内存活并分化为DA神经元,DA神经元与PD大鼠的运动功能改善关系密切。