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摘 要:为了探讨健脾补糖对过度训练大鼠骨骼肌的糖转运和MAPK转导通路中P38活性的影响。通过6周递增大负荷游泳训练,观察过度训练和健脾补糖对胃肠的吸收功能,骨骼肌的糖转运、储备和P38活性的影响。研究表明:1)过度训练脾虚的大鼠的骨骼肌MAPK信号转导系统的P38途径虽然被激活。但骨骼肌的葡萄糖转运和糖储存被低血糖和胰岛素所抑制。因此没有明显改善骨骼肌的肌糖原储备。2)健脾补糖从改善胃肠功能、增加能源物质的摄入、提高抗氧化能力等多靶点激活了P38,使骨骼肌对葡萄糖的转运速度与合成速度均加快,在末次运动后24 h就使肌糖原达到了明显的超量恢复状态。
关键词:健脾补糖;过度训练;脾虚;骨骼肌;GLUT4;P38;活性
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号:1007-3612(2007)09-1212-04
根据中医脾主运化和脾主肌肉的理论,以及西医疲劳的能量耗竭学说,我们将运动补糖健脾相结合,探讨骨骼肌信号转导系统的影响,在健脾和补糖对骨骼肌能源物质的代谢和自由基的代谢的基础上进一步探讨过度训练脾虚对骨骼肌MAPK信号转导通路中的P38的影响,它将为寻找预防过度训练的手段提供理论依据,同时也为验证中医“脾主肌肉”、“脾主运化”和“遥体苦劳则脾病”的理论提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物饲养 雄性Wistar大鼠95只,体重200 g左右,由沈阳市双义实验动物研究所提供,合格证号:SCXK(辽)2004-0012。二级条件饲养。
1.2 药物 四君子汤主要由人参、茯苓、白术、甘草四味药按质量1:1:1:1配方,加水煎煮,用纱布滤出药液,4℃贮存,待用。
1.3 实验设计 根据随机设计原则,将实验大鼠按体重随机分为五组,分组情况如下:
各组按朱全等建立的超负荷训练大鼠游泳模型略加改进进行训练[7](表2)。水池100 cm×60 cm×70 cm,水温(30±2)℃,水深50 cm,每只大鼠游泳面积>300 cm2。周日休息,但正常灌胃。
1.4 实验方法 1) D-木糖和血糖的含量测定采用。南京建成生物工程研究所;
2) 肌糖原含量测定。南京建成生物工程研究所;
3) GLUT4和P38蛋白表达的测定采用Western Blot方法。
1.5 统计学处理 所有实验数据用SPSS11.5软件包进行统计学处理,统计学方法为方差分析(LSD法和Tamhane’St2) 和简单相关分析,均采用均数±标准差(X±SD)表示,显著性水平分P<0.05和P<0.01。
2 结 果
2.1 6周递增负荷游泳训练各组大鼠D-木糖的变化: 与安静对照组相比,运动对照组大鼠的D-木糖水平明显降低,P<0.05。与运动对照组相比,健脾补糖运动,健脾运动组大鼠的D-木糖水平显著升高,P<0.01。与健脾补糖运动组相比,补糖运动组大鼠的D-木糖水平明显降低,P<0.05(表3)。
2.2 6周递增负荷游泳训练各组大鼠血糖浓度的变化 与安静对照组相比,运动对照组血糖浓度有下降趋势,但无显著性差异。与运动对照组相比,运动补糖组血糖浓度升高,P<0.05,健脾运动补糖组血糖浓度有升高趋势,但无显著性差异(表4)。
2.3 6周递增负荷游泳训练各组大鼠肌糖原含量的变化 与安静对照组相比,运动对照组的肌糖原含量无明显变化。与运动对照组相比,运动健脾补糖组的肌糖原含量显著升高,P<0.01。健脾运动、运动补糖组的肌糖原含量有升高趋势,但无显著性。与健脾运动、运动补糖组和安静对照组相比,健脾运动补糖组的肌糖原含量均显著升高,P<0.01(表4)。
2.4 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌葡萄转体蛋白4(GLUT4)的变化 与安静对照组相比,运动组大鼠的骨骼肌GLUT4有下降的趋势,但无统计学意义。与运动相比,运动健脾组和运动健脾补糖组骨骼肌GLUT4均显著升高,P<0.05。与运动健脾组相比,运动健脾补糖组大鼠的骨骼肌GLUT4显著下降,P<0.05(表5)。
2.5 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌PKB的变化 与对照组相比,运动组和运动健脾补糖组大鼠的骨骼肌P38的活性均明显升高,显著性分别为,P<0.01。与运动相比,运动健脾组、运动补糖组骨骼肌P38的活性显著下降,P<0.01。与运动健脾和运动补糖组相比,运动健脾补糖组骨骼肌的P38活性显著升高,P<0.01(表5)。
3 讨 论
3.1 健脾补糖对过度训练大鼠骨骼肌糖转运蛋白的影响
3.1.1 过度训练对骨骼肌糖转运蛋白的影响 过度训练对糖代谢的影响不仅表现在糖原的储存和糖原的分解上,还与糖转运有密切的关系,大强度的耐力训练引起机体糖原大量消耗,甚至排空,运动后骨骼肌具有再合成糖原的能力,其中通过骨骼肌上的糖转体蛋白4(GLUT4)从血液中摄取葡萄糖再合成糖原是很重要的途径。它的作用是在刺激因素的作用下,介导细胞外液的葡萄糖进入骨骼肌和脂肪等细胞。GLUT4受多种因素的调控,其中包括高胰岛素、低糖、运动、减体重等。
运动可以直接或间接通过影响血糖、胰岛素等调节骨骼肌的细胞内GLUT4的mRNA和蛋白表达。有研究表明,运动引起 GLUT4 表达的改变相当迅速。大鼠6 h游泳后1 d,GLUT4mRNA 和 GLUT4 蛋白分别增加2倍和1.5倍[1]。多数研究表明从1次运动到长期的耐力训练,均表现出运动引起骨骼肌GLUT4的基因和蛋白表达的增加。而我们的研究结果与上述的结果不同,6周的过度训练后大鼠的小腿腓肠肌的GLUT4的蛋白表达不但没有增加,反而出现下降的趋势,但无统计学的意义。
有学者推测[2]骨骼肌细胞具备了非常精细的葡萄糖转运的调节机制,以避免过度的运动诱发效应。试想运动后糖原大量消耗刺激GLUT4mRNA的大量表达如果转译合成大量的GLUT4蛋白,使其在机体运动后全身缺糖的状况下,将血液中的葡萄糖的大量的转运到肌肉,进而将可能发生暂时性低血糖的危险。无法保证大脑等重要的器官能源物质的供应,这是机体的一种保护性抑制,也有人将其称为前转录抑制。我们的研究结果也证实了这一假说,过度训练脾虚大鼠骨骼肌GLUT4蛋白含量的下降趋势与血糖、胰岛素的下降相一致,但都没有达到统计学的意义,推测可能与血糖和胰岛素的下降幅度有关。
虽然大多数的报道都是运动引起GLUT4mRNA和蛋白表達增加,但Asp等报道运动引起GLUT4下降,但他们采用的是离心运动降低了人[3]和大鼠[4]骨骼肌 GLUT4。并认为运动引起GLUT4下降的与肌肉损伤有关,在我们的研究中发现血浆CK的显著升高,这也是过度训练导致肌肉的微损伤的标志。由此推测运动后GLUT4的下降可能是GLUT4基因表达前抑制、肌糖原的恢复时相和肌肉损伤共同作用结果,其中哪一因素更重要还有待进一步研究。
3.1.2 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌GLUT4的影响 运动训练能增加肌糖原的含量,其主要原因是由于运动诱发肌肉细胞GLUT4基因表达增加所致。在运动后是否补充糖类,将对肌肉GLUT4蛋白产生明显的影响。在长时间运动肌糖原大量消耗后,肌肉细胞内部的GLUT4mRNA数量大幅度增加约高于对照组50%[5]。之后如果在运动后16 h不给予食物补充,肌肉细胞内的GLUT4mRNA将持续增加至原有的两倍,但此间GLUT4的转译效率却大幅度降低。推测骨骼肌细胞具备了非常精细的葡萄糖转运的调节机制,以避免过渡的运动诱发效应。运动后GLUT4基因的表达过程牵涉到至少两个先后的调节机制。在运动后缺乏糖类供应的过程,GLUT4基因的表达主要归因于前转译抑制的调节。如果立即补充葡萄糖,可能会引起后转录抑制。
Cheng IS[6]的研究發现运动诱导的大鼠骨骼GLUT4的mRNA表达的增加能被立即给予的葡萄糖下调。在随后的研究中还发现70%~75%最大摄氧量功率自行车运动60 min,在运动后给予高糖饮食组在血糖和胰岛素没有明显升高的情况下,GLUT4和己糖激酶的mRNA表达水平明显下降。 提示运动后的高糖饮食抑制了GLUT4的表达。Kentaro也发现运动导致骨骼肌GLUT-4增加[7]。给予高碳水化合物膳食后,出现了肌糖原超量代偿,但对胰岛素反应却下降归结为胰岛素信号转导通路环节被损害。我们的研究结果显示,运动补糖组大鼠的骨骼肌GLUT4蛋白含量与运动组相比有升高的趋势,但没有显著的差异,同时其肌糖原含量和血糖量均高于运动组。推测长期的运动补糖,增加了血糖和胰岛素的水平,促进了GLUT4的蛋白表达,加快了葡萄糖的转运,使肌肉中的肌糖原快速恢复,使运动诱导的GLUT4蛋白表达的增加起到抑制作用。因而使运动补糖组的GLUT4没有出现明显的增加。
有研究显示健脾具有增加脾虚大鼠骨骼肌的能源物质储备的作用,其机制被认为是脾胃功能改善,能源物质的消化吸收增加有关,可是骨骼肌能源物质的储存除于消化吸收有关,还与骨骼肌葡萄糖的转运和糖原的合成有关,但有关脾虚和健脾与GLUT4的关系还未见报道,我们的研究显示运动健脾组GLUT4明显高于运动组,其肌糖原的含量也出现了增高的趋势。而在运动健脾补糖组骨骼肌的GLUT4却明显的出现了回落,同时骨骼肌的肌糖原含量却出现了超量恢复,与其它4组均出现了极显著的差异。推测健脾不仅改善了胃肠功能,还增加了骨骼肌的葡萄糖的转运能力,使其在运动后及时补糖的前提下快速摄取血液中的葡萄糖,并快速的合成了肌糖原,在短时间内完成了肌糖原的超量恢复。肌糖原的超量代偿又抑制了健脾引起的GLUT4蛋白表达的增加。因此导致运动健脾补糖组的GLUT4出现了回落。但这一结果是否由于健脾补糖改善了信号转导系统而提高了骨骼肌的胰岛素敏感性,还是由于肌糖原的超量恢复引起了信号转导系统的损伤,还有待进一步研究。
3.2 健脾补糖对过度训练大鼠骨骼肌P38的影响
3.2.1 过度训练脾虚对大鼠骨骼肌P38的影响 丝裂原活化蛋白激酶信号系统(MAPKs)是一组非常保守的丝氨酸(苏氨酸)双重磷酸化蛋白激酶家族,在细胞生物信号转导中起着非常重要的作用。经典的MAPK激活途径是一种瀑布性的反应链:MAPK激激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAPKK)→MAPK。MAPK家族由5种亚类组成:ERK1/2、JNK/SAPK、p38、ERK3/4、ERK5。其中以p38研究的较为深入。
P38MAPK是由360个氨基酸组成的酪氨酸磷酸化蛋白激酶。它是1993年Brester等在研究高渗环境对酵母的影响时发现的,它是哺乳动物细胞中发现的第3种MAPK,新近资料表明p38MAPK存在6种异构形式。即P38MAPKα1/α2、p38MAPKβ1/β2、p38MAPKγ和p38MAPKδ。p38MAPKα和p38MAPKβ普遍表达,p38MAPKγ主要在肌肉中表达,p38MAPKδ主要在腺体组织中表达。研究发现,紫外线照射、促炎细胞因子(TNF-α,IL-1)、应激刺激(H2O2、热休克、高渗环境、蛋白合成的抑制剂、缺血/再灌注)以及脂多糖(LPS)与 G细菌细胞壁成分均可激活P38通路,其主要参与应激条件下细胞炎症反应和细胞调亡过程。
有研究发现,在长时间剧烈运动后,如马拉松跑后 P38MAPKγ的磷酸化可以升高4倍,但P38MAPKα的磷酸化无变化。Thong[8]等人报告生理浓度的胰岛素可以引发骨骼肌中适度而又持久的P38MAPK途径的活性。此外,运动对P38MAPK磷酸化的刺激效应可以至少持续3h,在伴有胰岛素刺激下可以一直保持很久。说明运动后骨骼肌对胰岛素的敏感性升高可能有P38MAPK的作用。运动激活P38MAPK分子的同时,也激活下游的信号分子MAPKAPK 2[9],运动对P38MAPK途径级联激活与葡萄糖转运呈正相关。还有试验发现用P38的拮抗剂SB-203580可以明显降低运动后骨骼肌对葡萄糖摄取。其中可能的机制是:P38可能参与运动激活细胞肌肉中GLUT-4的蛋白表达和易位,参与应激状态下骨骼肌细胞葡萄糖摄取的调节;P38能够提高运动后骨骼肌对胰岛素的敏感性。
为排除一次运动对P38的影响,朱红军利用糖尿病大鼠进行不同强度的8周耐力训练发现,最后一次运动结束后24 h骨骼肌中P38活性仍增高,且低强度运动组P38活性提高的更明显。提示8周的耐力训练使骨骼肌发生了适应性改变。然而也有研究发现在正常大鼠和人体耐力训练后48 h骨骼肌细胞P38蛋白含量和活性均降低[10],上述结果提示在正常血糖状态和高血糖状态下运动对骨骼肌细胞P38活性调节可能作用不一样。
我们的研究结果显示6周递增大负荷训练后,大鼠骨骼肌中P38活性升高,但并没有发现骨骼肌的糖原含量和GLUT4蛋白表达的升高。提示P38的升高并没有增加骨骼肌GLUT4的含量和肌糖原的储备,推测在过度运动后的低血糖和胰岛素的情况下,P38并没有影响GLUT4的表达以及肌糖原的储备。
有研究表明离体大鼠的骨骼肌中和p38MAPK磷酸化的增加,主要是由于应力变化所致;而与收缩相关的代谢和离子分布的变化,如活性氧产生、较高的机械应力性应激对p38的磷酸化有影响。我们研究显示,过度训练后大鼠骨骼肌中的MDA含量升高,SOD和总抗氧化能力下降,推测可能是运动引起P38增加的刺激因素。ROS可通过引起细胞脂质过氧化或调节细胞凋亡相关基因而诱导细胞凋亡。weinbrenner等[11]研究发现对心脏进行缺血再灌可以提高心肌P38MAPk的活性,国内学者王红霞[12]研究发现心脏缺血预处置提高了P38的活性,并认为P38的激活是心脏缺血预处置保护作用的关键环节。由此推测过度训练引发自由基生成的增加和抗氧化能力的下降是引发P38活性增加的机制之一。这一结果提示过度训练引发自由基生成的增加可能是激活P38的主要原因,同时P38对糖代谢的调节作用被运动后的低血糖和低胰岛素作用所抑制。
3.2.3 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌P38和ERK的影响 YCreer A(2005)研究表明运动后高糖饮食会提高骨骼肌MAPK系统的活性。为排除高糖引起的高胰岛素和高渗透压效应的影响。Yuichi Kawano[13]将骨骼肌分别暴露在高胰岛素、高渗透压和高葡萄糖的状态下研究其对刺激骨骼肌的MAPK级联的反应,发现肱二肌P38在高渗透压下磷酸化增加了5.2倍。然而胰岛素对其没有影响, 在高葡萄糖的暴露下P38磷酸化的趋势被抑制了23%,高血糖对PKB也没有造成影响。结论是短期的高葡萄糖暴露不影响P38的活性。我们的研究显示运动补糖组骨骼肌P38和ERK1/2的活性都出现下降的趋势,其中P38显著的低于运动组,但其血糖水平明显高于运动组,提示长期的补糖使血糖维持在较高的水平对P38和ERK1/2有一定的抑制作用,这种抑制作用抵消或高于自由基对其的激活作用。
有文献报道,p38MAPK可能通过提高GLUT4的内在活性来改善胰岛素的敏感性,从而增加葡萄糖的转运与摄取。最近运动对MAPK信号途径的调节越来越受到重视,p38MAPK被视为MAPK的下游激酶,抑制p38MAPK活性或表达无生物活性的p38MAPK均可抑制AMPK激活所致的糖转运。因此p38MAPK还可能参与了运动诱导的非胰岛素依赖的糖转运。研究表明离体大鼠的骨骼肌中和p38MAPK磷酸化的增加。分析其原因可能于血糖浓度、肌糖原含量和胰岛素的水平有关,也就是说在低血糖状态下,P38在促进骨骼肌摄取葡萄和肌糖原的合成方面作用不大,但在高血糖水平时它将与胰岛素一起促进糖的转运和糖原的合成,因此导致骨骼肌中的肌糖原含量明显高于运动组,甚至超过了安静对照组。
李丹[14]通过饮食不节加疲劳过度造成脾气虚证模型,并且在脾气虚证的基础上以温热伤阴造成脾阴虚证,研究发现心脏的MAPK活性明显升高,经滋脾阴方药治疗后心肌的MPAK活性进一步升高。我们的研究发现过度训练引起脾虚大鼠骨骼肌P38的活性明显升高,而运动健脾组的大鼠的骨骼肌P38有明显的回降。同时健脾组的SOD和总抗氧化能力回升,MDA也回降,提示健脾通过改善胃肠功能增加了各种营养素的吸收,其中包括大量的抗氧化剂的吸收,还有大量的微量元素(Cu、Zn、Mn等)的吸收,加快机体抗氧化酶的合成和抗氧化剂的恢复。提高了机体的抗氧化能力,减少了自由基的产生,减轻了对MAPK信号系统的刺激,使P38的活性也下降。另外骨骼肌中肌糖原的含量也恢复到了正常或超过了正常,肌糖原的大量恢复也可能是使P38恢复的原因之一。其中的机制有待进一步的研究。
运动健脾补糖的P38的蛋白出现了进一步的升高,同时出现了肌糖原的超量代偿,推测补糖使血糖水平的升高和四君子汤的抗氧化作用综合作用的结果。也提示自由基作用减弱的条件下,高血糖对P38具有较强的激活作用,并使其参与了对骨骼肌糖转运和糖原合成的调节,对肌糖原的超量代偿起到重要的作用。
4 结 论
1) 过度训练脾虚的大鼠的骨骼肌MAPK信号转导系统的P38途径虽然被激活。但骨骼肌的葡萄糖转运和糖储存被低血糖和胰岛素所抑制。因此没有明显改善骨骼肌的肌糖原储备。
2) 健脾补糖从改善胃肠功能、增加能源物质的摄入、提高抗氧化能力等多靶点激活了P38,使骨骼肌对葡萄糖的转运速度与合成速度均加快,在末次运动后24 h就使肌糖原达到了明显的超量恢复状态。
参考文献:
[1] Ren JM, Semenkovich CF, Gulve EA, et al. Exercise induces rapid increases in GLUT4 expression, glucose transport capacity, and insulin-stimulated glycogen storage in muscle. J Bo Chem,1994,269:14396-14401.
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[10] Carlson CJ, Koterski S, Sciotti RJ, Poccard GB, Rondinone CM. Enhanced basal activation of mitogen-activated protein kinases in adipocytes from type 2 diabetes: potential role of p38 in the downregulation of GLUT4 expression.Diabetes,2003,52(3):634-41.
[11] Weinbrenner C, Liu GS, Cohen MV, Downey JM. Phosphorylation of tyrosine 182 of p38 mitogen-activated protein kinase correlates with the protection of preconditioning in the rabbit heart.J Mol Cell Cardiol,1997,29(9):2383.
[12] 王紅霞,闫丽,芦玲巧,等.11,12-EET和缺血预处置对在体大鼠正常及再灌注心肌磷酸化ERK和p38MAPK表达的影响[J].中国病理生理杂志,2004,20(12):2194-2197.
[13] Yuichi Kawano, Jeffrey W. Ryder, Jorge Rincon, Juleen R. Zierath, Anna Krook, and Harriet Wallberg-Henriksson Evidence against high glucose as a mediator of ERK1/2 or p38 MAPK phosphorylation in rat skeletal muscleAm J Physiol Endocrinol Metab,2001,281:E1255-E1259.
[14] 李丹.脾阴虚大鼠模型MAPK信号转导与调控的研究[D].辽宁中医学院2004硕士研究生论文,2004.
关键词:健脾补糖;过度训练;脾虚;骨骼肌;GLUT4;P38;活性
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号:1007-3612(2007)09-1212-04
根据中医脾主运化和脾主肌肉的理论,以及西医疲劳的能量耗竭学说,我们将运动补糖健脾相结合,探讨骨骼肌信号转导系统的影响,在健脾和补糖对骨骼肌能源物质的代谢和自由基的代谢的基础上进一步探讨过度训练脾虚对骨骼肌MAPK信号转导通路中的P38的影响,它将为寻找预防过度训练的手段提供理论依据,同时也为验证中医“脾主肌肉”、“脾主运化”和“遥体苦劳则脾病”的理论提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物饲养 雄性Wistar大鼠95只,体重200 g左右,由沈阳市双义实验动物研究所提供,合格证号:SCXK(辽)2004-0012。二级条件饲养。
1.2 药物 四君子汤主要由人参、茯苓、白术、甘草四味药按质量1:1:1:1配方,加水煎煮,用纱布滤出药液,4℃贮存,待用。
1.3 实验设计 根据随机设计原则,将实验大鼠按体重随机分为五组,分组情况如下:
各组按朱全等建立的超负荷训练大鼠游泳模型略加改进进行训练[7](表2)。水池100 cm×60 cm×70 cm,水温(30±2)℃,水深50 cm,每只大鼠游泳面积>300 cm2。周日休息,但正常灌胃。
1.4 实验方法 1) D-木糖和血糖的含量测定采用。南京建成生物工程研究所;
2) 肌糖原含量测定。南京建成生物工程研究所;
3) GLUT4和P38蛋白表达的测定采用Western Blot方法。
1.5 统计学处理 所有实验数据用SPSS11.5软件包进行统计学处理,统计学方法为方差分析(LSD法和Tamhane’St2) 和简单相关分析,均采用均数±标准差(X±SD)表示,显著性水平分P<0.05和P<0.01。
2 结 果
2.1 6周递增负荷游泳训练各组大鼠D-木糖的变化: 与安静对照组相比,运动对照组大鼠的D-木糖水平明显降低,P<0.05。与运动对照组相比,健脾补糖运动,健脾运动组大鼠的D-木糖水平显著升高,P<0.01。与健脾补糖运动组相比,补糖运动组大鼠的D-木糖水平明显降低,P<0.05(表3)。
2.2 6周递增负荷游泳训练各组大鼠血糖浓度的变化 与安静对照组相比,运动对照组血糖浓度有下降趋势,但无显著性差异。与运动对照组相比,运动补糖组血糖浓度升高,P<0.05,健脾运动补糖组血糖浓度有升高趋势,但无显著性差异(表4)。
2.3 6周递增负荷游泳训练各组大鼠肌糖原含量的变化 与安静对照组相比,运动对照组的肌糖原含量无明显变化。与运动对照组相比,运动健脾补糖组的肌糖原含量显著升高,P<0.01。健脾运动、运动补糖组的肌糖原含量有升高趋势,但无显著性。与健脾运动、运动补糖组和安静对照组相比,健脾运动补糖组的肌糖原含量均显著升高,P<0.01(表4)。
2.4 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌葡萄转体蛋白4(GLUT4)的变化 与安静对照组相比,运动组大鼠的骨骼肌GLUT4有下降的趋势,但无统计学意义。与运动相比,运动健脾组和运动健脾补糖组骨骼肌GLUT4均显著升高,P<0.05。与运动健脾组相比,运动健脾补糖组大鼠的骨骼肌GLUT4显著下降,P<0.05(表5)。
2.5 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌PKB的变化 与对照组相比,运动组和运动健脾补糖组大鼠的骨骼肌P38的活性均明显升高,显著性分别为,P<0.01。与运动相比,运动健脾组、运动补糖组骨骼肌P38的活性显著下降,P<0.01。与运动健脾和运动补糖组相比,运动健脾补糖组骨骼肌的P38活性显著升高,P<0.01(表5)。
3 讨 论
3.1 健脾补糖对过度训练大鼠骨骼肌糖转运蛋白的影响
3.1.1 过度训练对骨骼肌糖转运蛋白的影响 过度训练对糖代谢的影响不仅表现在糖原的储存和糖原的分解上,还与糖转运有密切的关系,大强度的耐力训练引起机体糖原大量消耗,甚至排空,运动后骨骼肌具有再合成糖原的能力,其中通过骨骼肌上的糖转体蛋白4(GLUT4)从血液中摄取葡萄糖再合成糖原是很重要的途径。它的作用是在刺激因素的作用下,介导细胞外液的葡萄糖进入骨骼肌和脂肪等细胞。GLUT4受多种因素的调控,其中包括高胰岛素、低糖、运动、减体重等。
运动可以直接或间接通过影响血糖、胰岛素等调节骨骼肌的细胞内GLUT4的mRNA和蛋白表达。有研究表明,运动引起 GLUT4 表达的改变相当迅速。大鼠6 h游泳后1 d,GLUT4mRNA 和 GLUT4 蛋白分别增加2倍和1.5倍[1]。多数研究表明从1次运动到长期的耐力训练,均表现出运动引起骨骼肌GLUT4的基因和蛋白表达的增加。而我们的研究结果与上述的结果不同,6周的过度训练后大鼠的小腿腓肠肌的GLUT4的蛋白表达不但没有增加,反而出现下降的趋势,但无统计学的意义。
有学者推测[2]骨骼肌细胞具备了非常精细的葡萄糖转运的调节机制,以避免过度的运动诱发效应。试想运动后糖原大量消耗刺激GLUT4mRNA的大量表达如果转译合成大量的GLUT4蛋白,使其在机体运动后全身缺糖的状况下,将血液中的葡萄糖的大量的转运到肌肉,进而将可能发生暂时性低血糖的危险。无法保证大脑等重要的器官能源物质的供应,这是机体的一种保护性抑制,也有人将其称为前转录抑制。我们的研究结果也证实了这一假说,过度训练脾虚大鼠骨骼肌GLUT4蛋白含量的下降趋势与血糖、胰岛素的下降相一致,但都没有达到统计学的意义,推测可能与血糖和胰岛素的下降幅度有关。
虽然大多数的报道都是运动引起GLUT4mRNA和蛋白表達增加,但Asp等报道运动引起GLUT4下降,但他们采用的是离心运动降低了人[3]和大鼠[4]骨骼肌 GLUT4。并认为运动引起GLUT4下降的与肌肉损伤有关,在我们的研究中发现血浆CK的显著升高,这也是过度训练导致肌肉的微损伤的标志。由此推测运动后GLUT4的下降可能是GLUT4基因表达前抑制、肌糖原的恢复时相和肌肉损伤共同作用结果,其中哪一因素更重要还有待进一步研究。
3.1.2 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌GLUT4的影响 运动训练能增加肌糖原的含量,其主要原因是由于运动诱发肌肉细胞GLUT4基因表达增加所致。在运动后是否补充糖类,将对肌肉GLUT4蛋白产生明显的影响。在长时间运动肌糖原大量消耗后,肌肉细胞内部的GLUT4mRNA数量大幅度增加约高于对照组50%[5]。之后如果在运动后16 h不给予食物补充,肌肉细胞内的GLUT4mRNA将持续增加至原有的两倍,但此间GLUT4的转译效率却大幅度降低。推测骨骼肌细胞具备了非常精细的葡萄糖转运的调节机制,以避免过渡的运动诱发效应。运动后GLUT4基因的表达过程牵涉到至少两个先后的调节机制。在运动后缺乏糖类供应的过程,GLUT4基因的表达主要归因于前转译抑制的调节。如果立即补充葡萄糖,可能会引起后转录抑制。
Cheng IS[6]的研究發现运动诱导的大鼠骨骼GLUT4的mRNA表达的增加能被立即给予的葡萄糖下调。在随后的研究中还发现70%~75%最大摄氧量功率自行车运动60 min,在运动后给予高糖饮食组在血糖和胰岛素没有明显升高的情况下,GLUT4和己糖激酶的mRNA表达水平明显下降。 提示运动后的高糖饮食抑制了GLUT4的表达。Kentaro也发现运动导致骨骼肌GLUT-4增加[7]。给予高碳水化合物膳食后,出现了肌糖原超量代偿,但对胰岛素反应却下降归结为胰岛素信号转导通路环节被损害。我们的研究结果显示,运动补糖组大鼠的骨骼肌GLUT4蛋白含量与运动组相比有升高的趋势,但没有显著的差异,同时其肌糖原含量和血糖量均高于运动组。推测长期的运动补糖,增加了血糖和胰岛素的水平,促进了GLUT4的蛋白表达,加快了葡萄糖的转运,使肌肉中的肌糖原快速恢复,使运动诱导的GLUT4蛋白表达的增加起到抑制作用。因而使运动补糖组的GLUT4没有出现明显的增加。
有研究显示健脾具有增加脾虚大鼠骨骼肌的能源物质储备的作用,其机制被认为是脾胃功能改善,能源物质的消化吸收增加有关,可是骨骼肌能源物质的储存除于消化吸收有关,还与骨骼肌葡萄糖的转运和糖原的合成有关,但有关脾虚和健脾与GLUT4的关系还未见报道,我们的研究显示运动健脾组GLUT4明显高于运动组,其肌糖原的含量也出现了增高的趋势。而在运动健脾补糖组骨骼肌的GLUT4却明显的出现了回落,同时骨骼肌的肌糖原含量却出现了超量恢复,与其它4组均出现了极显著的差异。推测健脾不仅改善了胃肠功能,还增加了骨骼肌的葡萄糖的转运能力,使其在运动后及时补糖的前提下快速摄取血液中的葡萄糖,并快速的合成了肌糖原,在短时间内完成了肌糖原的超量恢复。肌糖原的超量代偿又抑制了健脾引起的GLUT4蛋白表达的增加。因此导致运动健脾补糖组的GLUT4出现了回落。但这一结果是否由于健脾补糖改善了信号转导系统而提高了骨骼肌的胰岛素敏感性,还是由于肌糖原的超量恢复引起了信号转导系统的损伤,还有待进一步研究。
3.2 健脾补糖对过度训练大鼠骨骼肌P38的影响
3.2.1 过度训练脾虚对大鼠骨骼肌P38的影响 丝裂原活化蛋白激酶信号系统(MAPKs)是一组非常保守的丝氨酸(苏氨酸)双重磷酸化蛋白激酶家族,在细胞生物信号转导中起着非常重要的作用。经典的MAPK激活途径是一种瀑布性的反应链:MAPK激激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAPKK)→MAPK。MAPK家族由5种亚类组成:ERK1/2、JNK/SAPK、p38、ERK3/4、ERK5。其中以p38研究的较为深入。
P38MAPK是由360个氨基酸组成的酪氨酸磷酸化蛋白激酶。它是1993年Brester等在研究高渗环境对酵母的影响时发现的,它是哺乳动物细胞中发现的第3种MAPK,新近资料表明p38MAPK存在6种异构形式。即P38MAPKα1/α2、p38MAPKβ1/β2、p38MAPKγ和p38MAPKδ。p38MAPKα和p38MAPKβ普遍表达,p38MAPKγ主要在肌肉中表达,p38MAPKδ主要在腺体组织中表达。研究发现,紫外线照射、促炎细胞因子(TNF-α,IL-1)、应激刺激(H2O2、热休克、高渗环境、蛋白合成的抑制剂、缺血/再灌注)以及脂多糖(LPS)与 G细菌细胞壁成分均可激活P38通路,其主要参与应激条件下细胞炎症反应和细胞调亡过程。
有研究发现,在长时间剧烈运动后,如马拉松跑后 P38MAPKγ的磷酸化可以升高4倍,但P38MAPKα的磷酸化无变化。Thong[8]等人报告生理浓度的胰岛素可以引发骨骼肌中适度而又持久的P38MAPK途径的活性。此外,运动对P38MAPK磷酸化的刺激效应可以至少持续3h,在伴有胰岛素刺激下可以一直保持很久。说明运动后骨骼肌对胰岛素的敏感性升高可能有P38MAPK的作用。运动激活P38MAPK分子的同时,也激活下游的信号分子MAPKAPK 2[9],运动对P38MAPK途径级联激活与葡萄糖转运呈正相关。还有试验发现用P38的拮抗剂SB-203580可以明显降低运动后骨骼肌对葡萄糖摄取。其中可能的机制是:P38可能参与运动激活细胞肌肉中GLUT-4的蛋白表达和易位,参与应激状态下骨骼肌细胞葡萄糖摄取的调节;P38能够提高运动后骨骼肌对胰岛素的敏感性。
为排除一次运动对P38的影响,朱红军利用糖尿病大鼠进行不同强度的8周耐力训练发现,最后一次运动结束后24 h骨骼肌中P38活性仍增高,且低强度运动组P38活性提高的更明显。提示8周的耐力训练使骨骼肌发生了适应性改变。然而也有研究发现在正常大鼠和人体耐力训练后48 h骨骼肌细胞P38蛋白含量和活性均降低[10],上述结果提示在正常血糖状态和高血糖状态下运动对骨骼肌细胞P38活性调节可能作用不一样。
我们的研究结果显示6周递增大负荷训练后,大鼠骨骼肌中P38活性升高,但并没有发现骨骼肌的糖原含量和GLUT4蛋白表达的升高。提示P38的升高并没有增加骨骼肌GLUT4的含量和肌糖原的储备,推测在过度运动后的低血糖和胰岛素的情况下,P38并没有影响GLUT4的表达以及肌糖原的储备。
有研究表明离体大鼠的骨骼肌中和p38MAPK磷酸化的增加,主要是由于应力变化所致;而与收缩相关的代谢和离子分布的变化,如活性氧产生、较高的机械应力性应激对p38的磷酸化有影响。我们研究显示,过度训练后大鼠骨骼肌中的MDA含量升高,SOD和总抗氧化能力下降,推测可能是运动引起P38增加的刺激因素。ROS可通过引起细胞脂质过氧化或调节细胞凋亡相关基因而诱导细胞凋亡。weinbrenner等[11]研究发现对心脏进行缺血再灌可以提高心肌P38MAPk的活性,国内学者王红霞[12]研究发现心脏缺血预处置提高了P38的活性,并认为P38的激活是心脏缺血预处置保护作用的关键环节。由此推测过度训练引发自由基生成的增加和抗氧化能力的下降是引发P38活性增加的机制之一。这一结果提示过度训练引发自由基生成的增加可能是激活P38的主要原因,同时P38对糖代谢的调节作用被运动后的低血糖和低胰岛素作用所抑制。
3.2.3 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌P38和ERK的影响 YCreer A(2005)研究表明运动后高糖饮食会提高骨骼肌MAPK系统的活性。为排除高糖引起的高胰岛素和高渗透压效应的影响。Yuichi Kawano[13]将骨骼肌分别暴露在高胰岛素、高渗透压和高葡萄糖的状态下研究其对刺激骨骼肌的MAPK级联的反应,发现肱二肌P38在高渗透压下磷酸化增加了5.2倍。然而胰岛素对其没有影响, 在高葡萄糖的暴露下P38磷酸化的趋势被抑制了23%,高血糖对PKB也没有造成影响。结论是短期的高葡萄糖暴露不影响P38的活性。我们的研究显示运动补糖组骨骼肌P38和ERK1/2的活性都出现下降的趋势,其中P38显著的低于运动组,但其血糖水平明显高于运动组,提示长期的补糖使血糖维持在较高的水平对P38和ERK1/2有一定的抑制作用,这种抑制作用抵消或高于自由基对其的激活作用。
有文献报道,p38MAPK可能通过提高GLUT4的内在活性来改善胰岛素的敏感性,从而增加葡萄糖的转运与摄取。最近运动对MAPK信号途径的调节越来越受到重视,p38MAPK被视为MAPK的下游激酶,抑制p38MAPK活性或表达无生物活性的p38MAPK均可抑制AMPK激活所致的糖转运。因此p38MAPK还可能参与了运动诱导的非胰岛素依赖的糖转运。研究表明离体大鼠的骨骼肌中和p38MAPK磷酸化的增加。分析其原因可能于血糖浓度、肌糖原含量和胰岛素的水平有关,也就是说在低血糖状态下,P38在促进骨骼肌摄取葡萄和肌糖原的合成方面作用不大,但在高血糖水平时它将与胰岛素一起促进糖的转运和糖原的合成,因此导致骨骼肌中的肌糖原含量明显高于运动组,甚至超过了安静对照组。
李丹[14]通过饮食不节加疲劳过度造成脾气虚证模型,并且在脾气虚证的基础上以温热伤阴造成脾阴虚证,研究发现心脏的MAPK活性明显升高,经滋脾阴方药治疗后心肌的MPAK活性进一步升高。我们的研究发现过度训练引起脾虚大鼠骨骼肌P38的活性明显升高,而运动健脾组的大鼠的骨骼肌P38有明显的回降。同时健脾组的SOD和总抗氧化能力回升,MDA也回降,提示健脾通过改善胃肠功能增加了各种营养素的吸收,其中包括大量的抗氧化剂的吸收,还有大量的微量元素(Cu、Zn、Mn等)的吸收,加快机体抗氧化酶的合成和抗氧化剂的恢复。提高了机体的抗氧化能力,减少了自由基的产生,减轻了对MAPK信号系统的刺激,使P38的活性也下降。另外骨骼肌中肌糖原的含量也恢复到了正常或超过了正常,肌糖原的大量恢复也可能是使P38恢复的原因之一。其中的机制有待进一步的研究。
运动健脾补糖的P38的蛋白出现了进一步的升高,同时出现了肌糖原的超量代偿,推测补糖使血糖水平的升高和四君子汤的抗氧化作用综合作用的结果。也提示自由基作用减弱的条件下,高血糖对P38具有较强的激活作用,并使其参与了对骨骼肌糖转运和糖原合成的调节,对肌糖原的超量代偿起到重要的作用。
4 结 论
1) 过度训练脾虚的大鼠的骨骼肌MAPK信号转导系统的P38途径虽然被激活。但骨骼肌的葡萄糖转运和糖储存被低血糖和胰岛素所抑制。因此没有明显改善骨骼肌的肌糖原储备。
2) 健脾补糖从改善胃肠功能、增加能源物质的摄入、提高抗氧化能力等多靶点激活了P38,使骨骼肌对葡萄糖的转运速度与合成速度均加快,在末次运动后24 h就使肌糖原达到了明显的超量恢复状态。
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