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摘要[目的]研究不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响。[方法]以巨峰葡萄果实为材料，应用实时荧光定量PCR技术对不同处理的相对表达量进行测定。[结果]ACC氧化酶基因、ACC合成酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因表达量明显上调；脱落酸调控基因表达量明显下调。[结论]该试验为从基因水平上研究葡萄保鲜机理奠定了基础。
关键词葡萄；果肉；衰老相关基因；基因表达
中图分类号S609+.3文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）16-0128-02
Effect of Unclean Storage on Senescencerelated Gene Expression in Grape Pulp
DU Chunwang，CHEN Lulu，QIAN Rongrong，CAI Xiaoning* ，CHEN Shoujiang* et al（College of Food Science，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing，Jiangsu 211171）
Abstract[Objective]To study the effect of unclean storage on senescencerelated gene expression in grape pulp.[Method]The relative expression of different treated genes was determined by realtime fluorescence quantitative PCR with Kyoho grape fruit as material.[Result]The expression of ACC oxidase gene，ACC synthase gene and phenylalanine ammonia lyase gene were significantly upregulated.The expression of abscisic acidregulated gene was downregulated.[Conclusion]The experiment laid the foundation for the study of grape preservation mechanism from the genetic level.
Key wordsGrape；Pulp；Senescencerelated gene；Gene expression
基金項目江苏省大学生实践创新训练计划项目（201511460050X）；南京晓庄学院重点项目（2015NXY03）；国家自然科学基金项目（C161002）。
作者简介杜春望（1996—），男，江苏盐城人，本科生，专业：食品科学与工程。*通讯作者，蔡小宁，研究员，硕士，从事生物工程研究；陈守江，教授，博士，从事食品生物工程研究。
收稿日期2017-04-19
葡萄营养丰富、风味独特，深受消费者的欢迎。目前葡萄产量占全世界水果产量的20%，为了延长葡萄的货架期，通常采用低温、气调、保鲜剂、抑菌等多种方法进行贮藏保鲜。已有很多关于葡萄采后贮藏保鲜技术及其生理生化的研究，尚缺少微生物侵染对葡萄贮藏过程中衰老相关基因表达影响的研究[1-6]。笔者应用实时荧光定量PCR技术从基因转录水平研究了常温条件下不洁贮藏对葡萄果肉中衰老相关基因表达的影响，以期为从基因水平研究葡萄保鲜机理奠定基础。
1材料与方法
1.1供试材料市售巨峰葡萄果实。
1.2试验设计于2016年8月初将新鲜健康的葡萄果实用1 000 μg/mL二氯异氰尿酸钠浸泡10 min，密封于保鲜袋中，另一处理是将染菌的葡萄果实与健康的葡萄果实混合放置于密封保鲜袋中，然后置于30 ℃生化培养箱中，7 d后取样提取总RNA。
1.3RNA提取使用北京艾德莱生物科技有限公司的EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit试剂盒，称取100～200 mg样品，按照试剂盒提供的说明书进行总RNA提取。
1.4cDNA第一链合成使用Biouniquer公司的SuperScript RT Kit试剂盒，按照试剂盒提供的说明书进行cDNA第一链合成。
1.5引物合成根据在GenBank搜索到的基因序列，按照预期PCR产物长度100～200 bp，应用DNAStar软件设计引物，然后交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列见表1。
1.6实时荧光定量PCR使用Funglyn Biotech公司的SMART-H荧光定量PCR进行荧光定量PCR分析，肌动蛋白基因作为内参基因，使用的试剂盒为Biouniquer公司的Realtime PCR Master Mix （SYBR Green I）。
2结果与分析
实时荧光定量PCR测定结果表明，ACC合成酶基因1和多酚氧化酶基因1未检测到信号，为此，在常规PCR分析中又针对这2个基因设计了另外2对引物，也未能扩增到DNA条带。其他8个基因均检测到信号，其中，ACC氧化酶基因1在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.471 043 870和135.045 335 600，染菌处理条件下表现为大幅升高；ACC合成酶基因2在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.786 853 341和372.432 027 500，染菌处理条件下表现为大幅升高；苯丙氨酸解氨酶基因在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.626 940 311和18.136 196 220，染菌处理条件下表现为明显升高；脱落酸调控基因2在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.277 860 629和0.006 093 837，染菌处理条件下表现为大幅下降；其他基因的mRNA相对表达量变化不大（表2）。结果表明，ACC氧化酶基因1、ACC合成酶基因2、苯丙氨酸解氨酶基因明顯参与了相关基因表达的正调控，脱落酸调控基因2则参与了相关基因表达的负调控。 3讨论与结论
葡萄贮藏保鲜的各种技术措施建立在贮藏保鲜过程中，葡萄果实内各种生理生化变化基础之上，生理生化变化反映在基因水平上表现为基因表达量的变化，目前涉及葡萄贮藏保鲜过程中各种基因表达变化与调节机理的研究很少，该试验应用实时荧光定量PCR技术测定了不洁保鲜条件下葡萄果肉中几个衰老相关基因的表达量，为进一步研究奠定了基础。
数据显示，ACC氧化酶基因1 和ACC合成酶基因2在染菌贮藏条件下，表达量大幅度上升。ACC氧化酶和ACC合成酶是调控乙烯合成的关键酶[7]，相应基因表达量急剧上升意味着乙烯的大量合成，乙烯数量的增加显然与衰老和病害反应有关，推测葡萄染菌后启动了乙烯的合成，用以激活相应的抗病基因表达，而产生抵抗病菌的物质[8-9]，在试验中观察到葡萄果肉色素含量增加，应与此有关。乙烯作为基因表达调控的信号分子，其大量产生，也进一步加快了葡萄衰老相关基因表达，最终导致葡萄果肉细胞中果胶等物质降解，从而使果实变软、腐烂，缩短了贮藏期。 一般认为很多衰老和抗病基因受到脱落酸的调控[9]，通过脱落酸含量上升，调节下游基因的表达。在该试验中，检测到脱落酸调控基因2的表达量明显下调，可能说明该基因是一个负调控脱落酸合成的基因，推测该基因起着非常重要的调控作用。苯丙氨酸解氨酶是研究较多的一种酶，此酶与苯丙烷类物质的合成密切相关，是合成的限速酶和关键酶[10]。在植物中，苯丙烷类物质可以作为类黄酮、木质素等物质合成的前期原料，这些次生代谢产物在参与抗病反应中起作用。葡萄果肉受到病菌侵染后，其基因表达水平提高，该试验结果清楚表明了这一点。经过多对引物的PCR检测，均未能检测到ACC合成酶基因1和多酚氧化酶基因1的表达信号，说明其可能不在葡萄果肉中表达，而在葡萄的其他部位表达。
试验结果显示，葡萄果肉是一种很好的研究微生物与植物相互作用的材料，进一步研究可以考虑测定葡萄果肉中的生化代谢产物和检测更多相关基因表达量的变化，以揭示更多参与调控的基因及其调控网络。
参考文献
[1]
李喜宏，陈丽，胡云峰，等.红地球葡萄保鲜设施与材料保障体系的建立[J].保鲜与加工，2002，2（5）：5-7.
[2] 陶谦，郇延军，王海鸥，等.两种葡萄的冰温高湿保鲜[J].无锡轻工大学学报，1999，18（4）：6-10.
[3] 杨虎清，陈策.二氧化硫和臭氧对巨峰葡萄酶促褐变的影响[J].福建果树，2001（3）：10-14.
[4] 王春生，李建华，赵猛，等.小帐气调贮藏龙眼葡萄试验[J].山西果树，1998（2）：8-9.
[5] 段绘叶，李东立，许文才，等.SO2和1-MCP保鲜剂对巨峰葡萄保鲜效果的影响[J].包裝工程，2013，34（23）：33-37，59.
[6] 朱东兴，胡冰，陈小祥，等.鲜食葡萄无公害贮藏保鲜处理[J].食品研究与开发，2010，31（1）：165-168.
[7] LIANG X，SHEN N F，THEOLOGIS A.Li+regulated 1aminocyclopropane1carboxylate synthase gene expression in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，1996，10（6）：1027-1036.
[8] GAUDET D A，WANG Y，PENNIKET C，et al.Morphological and molecular analyses of host and nonhost interactions involving barley and wheat and the covered smut pathogen Ustilago hordei[J].Molecular plantmicrobe interactions，2010，23（12）：1619-1634.
[9] 姜泽盛，戚海峰，张世忠.外源乙烯与脫落酸对牡丹切花衰老进程的影响[J].山东农业科学，2012，44（4）：40-44.
[10] 张宽朝，金青，蔡永萍，等.苯丙氨酸解氨酶与其在重要次生代谢产物调控中的作用研究进展[J].中国农学通报，2008，24（12）：59-62.
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（16）：130-132
关键词葡萄；果肉；衰老相关基因；基因表达
中图分类号S609+.3文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）16-0128-02
Effect of Unclean Storage on Senescencerelated Gene Expression in Grape Pulp
DU Chunwang，CHEN Lulu，QIAN Rongrong，CAI Xiaoning* ，CHEN Shoujiang* et al（College of Food Science，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing，Jiangsu 211171）
Abstract[Objective]To study the effect of unclean storage on senescencerelated gene expression in grape pulp.[Method]The relative expression of different treated genes was determined by realtime fluorescence quantitative PCR with Kyoho grape fruit as material.[Result]The expression of ACC oxidase gene，ACC synthase gene and phenylalanine ammonia lyase gene were significantly upregulated.The expression of abscisic acidregulated gene was downregulated.[Conclusion]The experiment laid the foundation for the study of grape preservation mechanism from the genetic level.
Key wordsGrape；Pulp；Senescencerelated gene；Gene expression
基金項目江苏省大学生实践创新训练计划项目（201511460050X）；南京晓庄学院重点项目（2015NXY03）；国家自然科学基金项目（C161002）。
作者简介杜春望（1996—），男，江苏盐城人，本科生，专业：食品科学与工程。*通讯作者，蔡小宁，研究员，硕士，从事生物工程研究；陈守江，教授，博士，从事食品生物工程研究。
收稿日期2017-04-19
葡萄营养丰富、风味独特，深受消费者的欢迎。目前葡萄产量占全世界水果产量的20%，为了延长葡萄的货架期，通常采用低温、气调、保鲜剂、抑菌等多种方法进行贮藏保鲜。已有很多关于葡萄采后贮藏保鲜技术及其生理生化的研究，尚缺少微生物侵染对葡萄贮藏过程中衰老相关基因表达影响的研究[1-6]。笔者应用实时荧光定量PCR技术从基因转录水平研究了常温条件下不洁贮藏对葡萄果肉中衰老相关基因表达的影响，以期为从基因水平研究葡萄保鲜机理奠定基础。
1材料与方法
1.1供试材料市售巨峰葡萄果实。
1.2试验设计于2016年8月初将新鲜健康的葡萄果实用1 000 μg/mL二氯异氰尿酸钠浸泡10 min，密封于保鲜袋中，另一处理是将染菌的葡萄果实与健康的葡萄果实混合放置于密封保鲜袋中，然后置于30 ℃生化培养箱中，7 d后取样提取总RNA。
1.3RNA提取使用北京艾德莱生物科技有限公司的EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit试剂盒，称取100～200 mg样品，按照试剂盒提供的说明书进行总RNA提取。
1.4cDNA第一链合成使用Biouniquer公司的SuperScript RT Kit试剂盒，按照试剂盒提供的说明书进行cDNA第一链合成。
1.5引物合成根据在GenBank搜索到的基因序列，按照预期PCR产物长度100～200 bp，应用DNAStar软件设计引物，然后交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列见表1。
1.6实时荧光定量PCR使用Funglyn Biotech公司的SMART-H荧光定量PCR进行荧光定量PCR分析，肌动蛋白基因作为内参基因，使用的试剂盒为Biouniquer公司的Realtime PCR Master Mix （SYBR Green I）。
2结果与分析
实时荧光定量PCR测定结果表明，ACC合成酶基因1和多酚氧化酶基因1未检测到信号，为此，在常规PCR分析中又针对这2个基因设计了另外2对引物，也未能扩增到DNA条带。其他8个基因均检测到信号，其中，ACC氧化酶基因1在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.471 043 870和135.045 335 600，染菌处理条件下表现为大幅升高；ACC合成酶基因2在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.786 853 341和372.432 027 500，染菌处理条件下表现为大幅升高；苯丙氨酸解氨酶基因在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.626 940 311和18.136 196 220，染菌处理条件下表现为明显升高；脱落酸调控基因2在无菌处理和染菌处理条件下mRNA相对表达量分别为0.277 860 629和0.006 093 837，染菌处理条件下表现为大幅下降；其他基因的mRNA相对表达量变化不大（表2）。结果表明，ACC氧化酶基因1、ACC合成酶基因2、苯丙氨酸解氨酶基因明顯参与了相关基因表达的正调控，脱落酸调控基因2则参与了相关基因表达的负调控。 3讨论与结论
葡萄贮藏保鲜的各种技术措施建立在贮藏保鲜过程中，葡萄果实内各种生理生化变化基础之上，生理生化变化反映在基因水平上表现为基因表达量的变化，目前涉及葡萄贮藏保鲜过程中各种基因表达变化与调节机理的研究很少，该试验应用实时荧光定量PCR技术测定了不洁保鲜条件下葡萄果肉中几个衰老相关基因的表达量，为进一步研究奠定了基础。
数据显示，ACC氧化酶基因1 和ACC合成酶基因2在染菌贮藏条件下，表达量大幅度上升。ACC氧化酶和ACC合成酶是调控乙烯合成的关键酶[7]，相应基因表达量急剧上升意味着乙烯的大量合成，乙烯数量的增加显然与衰老和病害反应有关，推测葡萄染菌后启动了乙烯的合成，用以激活相应的抗病基因表达，而产生抵抗病菌的物质[8-9]，在试验中观察到葡萄果肉色素含量增加，应与此有关。乙烯作为基因表达调控的信号分子，其大量产生，也进一步加快了葡萄衰老相关基因表达，最终导致葡萄果肉细胞中果胶等物质降解，从而使果实变软、腐烂，缩短了贮藏期。 一般认为很多衰老和抗病基因受到脱落酸的调控[9]，通过脱落酸含量上升，调节下游基因的表达。在该试验中，检测到脱落酸调控基因2的表达量明显下调，可能说明该基因是一个负调控脱落酸合成的基因，推测该基因起着非常重要的调控作用。苯丙氨酸解氨酶是研究较多的一种酶，此酶与苯丙烷类物质的合成密切相关，是合成的限速酶和关键酶[10]。在植物中，苯丙烷类物质可以作为类黄酮、木质素等物质合成的前期原料，这些次生代谢产物在参与抗病反应中起作用。葡萄果肉受到病菌侵染后，其基因表达水平提高，该试验结果清楚表明了这一点。经过多对引物的PCR检测，均未能检测到ACC合成酶基因1和多酚氧化酶基因1的表达信号，说明其可能不在葡萄果肉中表达，而在葡萄的其他部位表达。
试验结果显示，葡萄果肉是一种很好的研究微生物与植物相互作用的材料，进一步研究可以考虑测定葡萄果肉中的生化代谢产物和检测更多相关基因表达量的变化，以揭示更多参与调控的基因及其调控网络。
参考文献
[1]
李喜宏，陈丽，胡云峰，等.红地球葡萄保鲜设施与材料保障体系的建立[J].保鲜与加工，2002，2（5）：5-7.
[2] 陶谦，郇延军，王海鸥，等.两种葡萄的冰温高湿保鲜[J].无锡轻工大学学报，1999，18（4）：6-10.
[3] 杨虎清，陈策.二氧化硫和臭氧对巨峰葡萄酶促褐变的影响[J].福建果树，2001（3）：10-14.
[4] 王春生，李建华，赵猛，等.小帐气调贮藏龙眼葡萄试验[J].山西果树，1998（2）：8-9.
[5] 段绘叶，李东立，许文才，等.SO2和1-MCP保鲜剂对巨峰葡萄保鲜效果的影响[J].包裝工程，2013，34（23）：33-37，59.
[6] 朱东兴，胡冰，陈小祥，等.鲜食葡萄无公害贮藏保鲜处理[J].食品研究与开发，2010，31（1）：165-168.
[7] LIANG X，SHEN N F，THEOLOGIS A.Li+regulated 1aminocyclopropane1carboxylate synthase gene expression in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，1996，10（6）：1027-1036.
[8] GAUDET D A，WANG Y，PENNIKET C，et al.Morphological and molecular analyses of host and nonhost interactions involving barley and wheat and the covered smut pathogen Ustilago hordei[J].Molecular plantmicrobe interactions，2010，23（12）：1619-1634.
[9] 姜泽盛，戚海峰，张世忠.外源乙烯与脫落酸对牡丹切花衰老进程的影响[J].山东农业科学，2012，44（4）：40-44.
[10] 张宽朝，金青，蔡永萍，等.苯丙氨酸解氨酶与其在重要次生代谢产物调控中的作用研究进展[J].中国农学通报，2008，24（12）：59-62.
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（16）：130-132