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【摘要】目的：对虎杖的酒制工艺进行条件考察，获得最佳炮制工艺。方法：采用单因素考察方法确定虎杖药材焖润时间，采用正交实验设计，以大黄素含量为评价指标，采用HPLC进行含量测定，考察加酒量、烘制时间、烘制温度等3 个因素对虎杖酒制工艺的影响。结果：最佳提取工艺为药材焖润时间80min、加酒量15ml/100g饮片、烘制时间30min、烘制温度60℃。结论：加酒量对虎杖酒制提取工艺影响最大。
【关键词】虎杖；大黄素；正交实验；HPLC
【中图分类号】R283.3 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2016）07-0017-02
Abstract：Objective To establish a method for determining the emodin in Rhizoma Polygoni Cuspidati from sample baked with yellow rice wine by HPLC.Methods Single factor test was used to evaluate soaking time.Orthogonal test was used to evaluate the influence of the 3 factors， including the amount of yellow rice wine，baking time and temperature. The content of emodin was determined by HPLC.Results The optimum extraction is as follows： 80 min soaking time， the amount of yellow rice wine is 15ml/（100g），baking 30 min and 60℃.Conclusion The amount of yellow rice wine significantly influenced the yield of emodin very much.
Keywords：Rhizoma Polygoni Cuspidati； Emodin； Orthogonal test； HPLC
虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥块茎和根，其性微寒，味微苦，具有清热利湿、散瘀定痛、通便解毒、止咳化痰等功效。现代炮制以“洗净，闷润至透， 切厚片”[1]的润品为主。虎杖的主要成分之一大黄素具有抗肿瘤、抗病毒 、抗炎、平喘等作用[2-3] ，现常用作控制虎杖质量的主要成分之一。近年来，虎杖的研究多见于有效成分、药理药效等研究，但炮制方面尤其是酒制法缺乏其提取工艺的系统研究。本文采用正交试验对虎杖酒制工艺进行工艺优化，为合理制订虎杖饮片质量提供可行性依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪（含 LC-6AD 高压泵，SPD -20A 型紫外线检测器， CBM-20A 色谱工作站）；KQ-400DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；9FZ-15B型多用粉碎机（四川省国营简阳机械厂）；TGL-40B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；101-3-S型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械）。
1.2 材料 大黄素对照品（批号：110756-201512，中国食品药品检定所）；虎杖药材经本院刘寿养教授鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥块茎和根；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，黄酒（浙江绍兴）为市售品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Alltima C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸（80∶20）；流速：1.0ml/min ；检测波长：254nm ；柱温：室温。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品2.50mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，浓度为0.1mg/ ml。
2.3 供试品溶液的制备 取虎杖饮片，加黄酒拌匀，闷润，按照因素水平表（表1）的方法炮制，趁热粉碎，过65目。取炮制品细粉，称定约0.1g，置于10ml具塞离心管中，加入2.5mol/L的硫酸5ml，于超声器上混匀，置沸水浴维持 30min，取出，加水 4.0ml，振荡使均匀，离心10min（2500r/min），上清液经滤纸滤过，滤液弃去，滤膜连离心沉淀反复加甲醇用超声波振荡提取，每次5min，共8次，每次加甲醇 5ml，过滤，滤液于 50ml 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，备用。
2.4 线性关系 精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别精密吸取对照品20μl进行测定，以峰面积为横坐标，溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为Y=3543.02704X-55.410426（r=0.9998） ， 结果表明：大黄素在 10 ～ 100μg范围内具有良好的线性关系。
2.5 稳定性试验 于0、4、8、12、24h分别吸取大黄素对照液 20μl测定，结果表明在 24h 基本稳定，RSD 为 0.74 %。
2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液 20μl，重复进样 5 次，测定峰面积，求得 RSD 为0.08 %（n=5）。
2.7 重复性试验 取虎杖按照“2.3供试品溶液的制备”方法制备，平行制备5份，按“2.1色谱条件”测定大黄素含量，求得RSD为0.48 %（n=5）。
2.8 回收率试验 精密称取虎杖酒炙品细粉约 0.05g（5份），分别定量加入大黄素对照品溶液 （浓度为0.1mg/ml）按“2.1色谱条件”测定大黄素含量， 测得平均回收率为 98 .7 %，RSD=1.01 %。 2.9 单因素考察 考察虎杖药材焖润时间。取虎杖饮片100g三份，分别加黄酒10ml（加水稀释一倍）拌匀，分别焖润60、70、80 min，置干燥箱内60℃恒温1h，取出趁热粉碎，按照“2.3供试品溶液的制备”方法制备，按照“2.1色谱条件”测定大黄素含量。实验结果表明，焖润时间80 min大黄素含量最高。
2.10 酒制工艺研究 结合传统酒制法的要求，选择加酒量、烘制时间与温度3个因素为考察因素，以虎杖中主要有效成分大黄素为考察指标，取净虎杖饮片100g，选用L9（34）正交表进行实验，试验安排及结果见表1，2。
由实验结果可知： 各因素对提取效果的影响大小顺序为： A（加酒量）> B（烘制时间） > C（烘制温度），A 因素影响差异有统计学意义（P<0.05），B因素与C因素影响差异无统计学意义。直观分析得提取工艺为A2B1C2。即加酒量15ml，烘制时间30min，烘制温度60℃。
2.11 工艺验证 取虎杖100g，加酒量15ml（加水稀释1倍），焖润80min，放入60℃烘箱，烘制30min，平行实验3次。结果大黄素平均含量为1.933%，与正交实验各工艺结果比较均相对较高。
3 讨论
3.1 文中加酒焖润时，需加水稀释一倍，可以避免浸泡药材局部浓度太高，同时可以加大药材与液体的接触面积，浸泡充分。实验对虎杖酒制工艺进行工艺优化，规范酒制工序，为合理制订虎杖饮片质量提供可行性依据。
3.2 虎杖主要成分为大黄素，具有抗病毒、抗炎、抗菌、平喘及降压等作用，虎杖经酒炙后大黄素含量与生品的大黄素含量后续需进一步做补充对比，且虎杖酒制品是否对药效产生影响有待进一步研究。
参考文献
[1] 黄拓，江海燕，卢忠朋， 等. 虎杖炮制的历史沿革及其飲片质量研究概况[J].中医药学刊，2005， 23（9）： 1611-1612.
[2] 陈易彬，孙宝祥，陈佳希， 等. 虎杖中白藜芦醇的稳定性研究[J]. 中药材，2007， 30（7）： 805-807.
[3] 陈怡，杭太俊，许欣欣，等. 不同产地虎杖中总黄酮含量的比较[J].江苏药学与临床研究，2006， 14（6）： 399-401.
（收稿日期：2016.01.26）
【关键词】虎杖；大黄素；正交实验；HPLC
【中图分类号】R283.3 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2016）07-0017-02
Abstract：Objective To establish a method for determining the emodin in Rhizoma Polygoni Cuspidati from sample baked with yellow rice wine by HPLC.Methods Single factor test was used to evaluate soaking time.Orthogonal test was used to evaluate the influence of the 3 factors， including the amount of yellow rice wine，baking time and temperature. The content of emodin was determined by HPLC.Results The optimum extraction is as follows： 80 min soaking time， the amount of yellow rice wine is 15ml/（100g），baking 30 min and 60℃.Conclusion The amount of yellow rice wine significantly influenced the yield of emodin very much.
Keywords：Rhizoma Polygoni Cuspidati； Emodin； Orthogonal test； HPLC
虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥块茎和根，其性微寒，味微苦，具有清热利湿、散瘀定痛、通便解毒、止咳化痰等功效。现代炮制以“洗净，闷润至透， 切厚片”[1]的润品为主。虎杖的主要成分之一大黄素具有抗肿瘤、抗病毒 、抗炎、平喘等作用[2-3] ，现常用作控制虎杖质量的主要成分之一。近年来，虎杖的研究多见于有效成分、药理药效等研究，但炮制方面尤其是酒制法缺乏其提取工艺的系统研究。本文采用正交试验对虎杖酒制工艺进行工艺优化，为合理制订虎杖饮片质量提供可行性依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪（含 LC-6AD 高压泵，SPD -20A 型紫外线检测器， CBM-20A 色谱工作站）；KQ-400DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；9FZ-15B型多用粉碎机（四川省国营简阳机械厂）；TGL-40B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；101-3-S型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械）。
1.2 材料 大黄素对照品（批号：110756-201512，中国食品药品检定所）；虎杖药材经本院刘寿养教授鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥块茎和根；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，黄酒（浙江绍兴）为市售品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Alltima C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸（80∶20）；流速：1.0ml/min ；检测波长：254nm ；柱温：室温。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品2.50mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，浓度为0.1mg/ ml。
2.3 供试品溶液的制备 取虎杖饮片，加黄酒拌匀，闷润，按照因素水平表（表1）的方法炮制，趁热粉碎，过65目。取炮制品细粉，称定约0.1g，置于10ml具塞离心管中，加入2.5mol/L的硫酸5ml，于超声器上混匀，置沸水浴维持 30min，取出，加水 4.0ml，振荡使均匀，离心10min（2500r/min），上清液经滤纸滤过，滤液弃去，滤膜连离心沉淀反复加甲醇用超声波振荡提取，每次5min，共8次，每次加甲醇 5ml，过滤，滤液于 50ml 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，备用。
2.4 线性关系 精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别精密吸取对照品20μl进行测定，以峰面积为横坐标，溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为Y=3543.02704X-55.410426（r=0.9998） ， 结果表明：大黄素在 10 ～ 100μg范围内具有良好的线性关系。
2.5 稳定性试验 于0、4、8、12、24h分别吸取大黄素对照液 20μl测定，结果表明在 24h 基本稳定，RSD 为 0.74 %。
2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液 20μl，重复进样 5 次，测定峰面积，求得 RSD 为0.08 %（n=5）。
2.7 重复性试验 取虎杖按照“2.3供试品溶液的制备”方法制备，平行制备5份，按“2.1色谱条件”测定大黄素含量，求得RSD为0.48 %（n=5）。
2.8 回收率试验 精密称取虎杖酒炙品细粉约 0.05g（5份），分别定量加入大黄素对照品溶液 （浓度为0.1mg/ml）按“2.1色谱条件”测定大黄素含量， 测得平均回收率为 98 .7 %，RSD=1.01 %。 2.9 单因素考察 考察虎杖药材焖润时间。取虎杖饮片100g三份，分别加黄酒10ml（加水稀释一倍）拌匀，分别焖润60、70、80 min，置干燥箱内60℃恒温1h，取出趁热粉碎，按照“2.3供试品溶液的制备”方法制备，按照“2.1色谱条件”测定大黄素含量。实验结果表明，焖润时间80 min大黄素含量最高。
2.10 酒制工艺研究 结合传统酒制法的要求，选择加酒量、烘制时间与温度3个因素为考察因素，以虎杖中主要有效成分大黄素为考察指标，取净虎杖饮片100g，选用L9（34）正交表进行实验，试验安排及结果见表1，2。
由实验结果可知： 各因素对提取效果的影响大小顺序为： A（加酒量）> B（烘制时间） > C（烘制温度），A 因素影响差异有统计学意义（P<0.05），B因素与C因素影响差异无统计学意义。直观分析得提取工艺为A2B1C2。即加酒量15ml，烘制时间30min，烘制温度60℃。
2.11 工艺验证 取虎杖100g，加酒量15ml（加水稀释1倍），焖润80min，放入60℃烘箱，烘制30min，平行实验3次。结果大黄素平均含量为1.933%，与正交实验各工艺结果比较均相对较高。
3 讨论
3.1 文中加酒焖润时，需加水稀释一倍，可以避免浸泡药材局部浓度太高，同时可以加大药材与液体的接触面积，浸泡充分。实验对虎杖酒制工艺进行工艺优化，规范酒制工序，为合理制订虎杖饮片质量提供可行性依据。
3.2 虎杖主要成分为大黄素，具有抗病毒、抗炎、抗菌、平喘及降压等作用，虎杖经酒炙后大黄素含量与生品的大黄素含量后续需进一步做补充对比，且虎杖酒制品是否对药效产生影响有待进一步研究。
参考文献
[1] 黄拓，江海燕，卢忠朋， 等. 虎杖炮制的历史沿革及其飲片质量研究概况[J].中医药学刊，2005， 23（9）： 1611-1612.
[2] 陈易彬，孙宝祥，陈佳希， 等. 虎杖中白藜芦醇的稳定性研究[J]. 中药材，2007， 30（7）： 805-807.
[3] 陈怡，杭太俊，许欣欣，等. 不同产地虎杖中总黄酮含量的比较[J].江苏药学与临床研究，2006， 14（6）： 399-401.
（收稿日期：2016.01.26）