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目的 结合荧光蛋白标记技术和激光共聚焦显微镜三维重建技术观察体外构建的组织工程骨及其体内移植情况,为筛选优良的支架材料和三维构建方法提供技术支持.方法 取2岁龄青山羊(体重约25 kg)髂骨骨髓,利用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养BMSCs,并通过流式细胞技术检测表面分子CD29、CD60L、CD45和CD44表达情况.将质粒pLEGFP-N1扩增、提取后酶切鉴定.用脂质体转染的方法将质粒转染到PT67包装细胞,G418筛选后扩增,获取病毒液.根据测定的滴度转染BMSCs,获得绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达的BMSCs,扩增后作为种子细胞,以脱钙骨基质作为支架材料构建组织工程骨,并利用激光共聚焦显微镜观察种子细胞.将构建的组织工程骨移植到山羊股骨缺损处,利用激光共聚焦显微镜观察其存活和分布情况.结果 获得的细胞呈成纤维细胞状,CD29和CD44呈阳性表达,CD60L和CD45呈阴性.质粒DLEGFP-N1用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、sal,Ⅰ和Bgl Ⅱ内切酶酶切后,凝胶电泳可见其相对分子质量约6 900 bp.将pLEGFP-N1转染到PT67包装细胞扩增后获取病毒液.根据测定的滴度(1.3×106 cfu/mL)转染BMSCs,获得GFP表达阳性的BMSCs克隆.激光共聚焦显微镜三维立体成像技术观察到BMSCs在组织工程骨支架上分布、增殖和迁移.将构建的组织工程骨移植到山羊股骨缺损处,28 d后激光共聚焦显微镜观察到GFP阳性细胞在移植区仍存在.结论 荧光蛋白标记技术结合激光共聚焦显微镜三维重建技术可很好地观察支架上和移植体内的细胞,为组织工程产物三维培养的立体观察提供了可行方法.