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目的:本文旨在通过检测T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3,TIM-3)在人食管鳞癌(全称ESCC)组织及相应癌旁正常组织中的表达变化,分析其与患者临床病理特征及术后生存时间之间的关系。通过靶向沉默TIM-3分子的表达,研究TIM-3对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及周期分布的生物学特性的影响,并进一步探讨TIM-3促进食管癌细胞侵袭转移的作用机制。方法:1采用实时荧光定量PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测人食管癌组织及相应癌旁正常组织中TIM-3 m RNA的表达水平。2采用免疫组织化学方法检测人食管癌组织及相应癌旁正常组织中TIM-3蛋白的表达水平,并分析其表达与患者临床病理特征及预后的关系。3采用免疫组织化学方法检测人食管癌组织中CD8+T细胞的浸润程度,并分析食管癌组织中TIM-3的表达水平与CD8+T细胞浸润程度的相关性。4采用qRT-PCR和Western blotting方法分别检测人食管癌细胞系Eca109、TE-1、TE-13、KYSE30和KYSE170中TIM-3 m RNA及蛋白的表达情况。5构建沉默TIM-3的真核表达载体(psi-U6-TIM-3),转染食管癌Eca109和TE-1细胞,经嘌呤霉素筛选2周,挑取单克隆扩大培养后获得稳定敲低TIM-3表达的Eca109-sh TIM-3和TE-1-sh TIM-3细胞及各自阴性对照Eca109-NC和TE-1-NC细胞。采用流式细胞技术检测TIM-3sh RNA的转染效率;采用qRT-PCR和Western blotting方法检测下调TIM-3表达的有效性。6采用MTS法和平板克隆形成实验检测敲低TIM-3基因表达对食管癌细胞增殖能力的影响。7采用划痕愈合实验和Transwell迁移实验检测敲低TIM-3基因表达对食管癌细胞迁移能力的影响。8采用Matrigel侵袭实验检测敲低TIM-3基因表达对食管癌细胞侵袭能力的影响。9采用流式细胞技术检测敲低TIM-3基因表达对食管癌细胞凋亡及周期分布的影响。10采用qRT-PCR和Western blotting方法检测敲低TIM-3基因表达对食管癌细胞转移相关分子(MMP-9,TIMP-1,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin)表达水平的影响。11采用Western blotting方法检测敲低TIM-3基因表达对食管癌细胞Akt/GSK-3β/Snail信号通路的影响。结果:1 qRT-PCR检测结果显示,40例食管癌组织中TIM-3 m RNA的表达水平显著高于相应癌旁正常组织(0.002±0.0007 vs.0.001±0.0004),差异具有统计学意义(P<0.001)。2免疫组织化学分析结果显示,TIM-3蛋白主要定位于食管癌细胞的胞浆和胞膜。64例食管癌组织中,TIM-3蛋白阳性(得分>1)表达率为85.9%(55/64);相应癌旁正常组织中,TIM-3蛋白阳性表达率为10.9%(7/64)。55例TIM-3阳性食管癌组织中,19例(34.5%)显示TIM-3低表达(得分≤3),36例(65.5%)显示TIM-3高表达(得分>3);然而,7例TIM-3阳性癌旁正常组织均显示TIM-3低表达。统计学分析发现,食管癌组织中TIM-3蛋白的表达水平明显高于相应癌旁正常组织(P<0.001)。食管癌组织中TIM-3蛋白的表达水平与患者TNM分期(P=0.008)、淋巴结转移(P=0.042)及肿瘤浸润深度(P=0.042)密切相关,而与患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,TIM-3高表达组患者的总体生存率明显低于低表达组患者,差异具有统计学意义(P=0.001)。统计学分析发现,TIM-3高表达组患者的5年生存率为9%,中位生存时间为22个月;TIM-3低表达组患者的5年生存率为19.2%,中位生存时间为41个月。3免疫组化染色结果显示,64例食管癌组织中,CD8+T细胞低度浸润25例,高度浸润39例。Spearman相关性分析显示,64例食管癌组织中,TIM-3的表达水平与CD8+T细胞浸润程度呈负相关(P=0.008)。4 qRT-PCR检测结果显示,TIM-3 m RNA在5种食管癌细胞系Eca109、TE-1、TE-13、KYSE30和KYSE170中均有不同程度的组成性表达。其中,TIM-3 m RNA在Eca109和TE-1细胞系中的表达量相对较高。Western blotting检测结果显示,与TIM-3 m RNA表达情况一致,TIM-3蛋白在Eca109和TE-1细胞系中的表达量相对较高。5为了研究TIM-3对食管癌细胞生物学特性的影响,选择TIM-3表达量相对较高的Eca109和TE-1细胞系敲低TIM-3的表达。流式细胞技术分析结果显示,Eca109-sh TIM-3和Eca109-NC细胞的转染效率分别为91.5%和93.2%;TE-1-sh TIM-3和TE-1-NC细胞的转染效率分别为85.3%和87.7%。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,Eca109-sh TIM-3细胞中TIM-3的表达水平明显低于空转染Eca109-NC细胞及未转染Eca109细胞(P<0.001)。同样,TE-1-sh TIM-3细胞中TIM-3的表达水平明显低于空转染TE-1-NC细胞及未转染TE-1细胞(P<0.001)。以上结果说明,通过稳定转染TIM-3sh RNA可有效下调Eca109和TE-1细胞中TIM-3的表达。6 MTS检测结果显示,接种于96孔板24、48、72h后,转染TIM-3sh RNA的Eca109和TE-1细胞的吸光度值均明显低于各自空转染组及未转染组(P<0.01);平板克隆形成实验结果显示,与各自空转染组及未转染组细胞相比,转染TIM-3sh RNA后Eca109和TE-1细胞的克隆形成能力均显著降低(P<0.001)。7划痕愈合实验结果显示,与各自空转染组及未转染组细胞相比,划痕24、48h后转染TIM-3sh RNA的Eca109和TE-1细胞向划痕边缘的爬行速度明显减慢,划痕缺损修复缓慢,划痕间距相对较宽,差异均具有统计学意义(P<0.01)。Transwell迁移实验结果显示,与各自空转染组及未转染组细胞相比,转染TIM-3sh RNA后Eca109和TE-1细胞穿过基底膜的数量均显著降低(P<0.001)。8 Matrigel侵袭实验结果显示,与各自空转染组及未转染组细胞相比,转染TIM-3sh RNA后Eca109和TE-1细胞穿过基底膜的数量均显著降低(P<0.001)。9流式细胞技术检测细胞凋亡结果显示,与各自空转染组及未转染组细胞相比,转染TIM-3sh RNA后Eca109和TE-1细胞的凋亡率差异均无统计学意义(P>0.05);流式细胞技术检测细胞周期分布结果显示,与各自空转染组及未转染组细胞相比,转染TIM-3sh RNA后Eca109和TE-1细胞的G0/G1期细胞比例均显著增加(P<0.001),S期细胞比例均显著下降(P<0.001)。10 qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,敲低TIM-3基因表达能够显著下调Eca109和TE-1细胞中MMP-9、N-cadherin和Vimentin基因及蛋白的表达水平,上调TIMP-1和E-cadherin基因及蛋白的表达水平(P<0.001)。11 Western blotting检测结果显示,敲低TIM-3基因表达能够显著下调Eca109和TE-1细胞中p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和EMT相关转录因子Snail的表达水平(P<0.001),但不影响总Akt和总GSK-3β的表达水平(P>0.05)。结论:1 TIM-3在人食管癌组织中异常高表达,且与肿瘤进展及患者不良预后密切相关,有望成为食管癌患者新的治疗靶点和预后标记。2 TIM-3在人食管癌组织中的表达与CD8+T细胞浸润程度呈负相关,提示TIM-3可能参与食管癌的免疫逃逸。3敲低TIM-3基因表达可使食管癌细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制食管癌细胞的增殖能力。4 TIM-3至少部分通过Akt/GSK-3β/Snail信号通路诱导EMT,从而促进食管癌侵袭转移。