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目的:探讨在体内Lkb1在树突状细胞（DCs）调控CD8+Foxp3+调节性T细胞（Treg）扩增中的作用及机制。方法:（1）利用Cre-loxp敲基因系统获得在DCs中特异性敲除Lkb1的敲基因小鼠。首先我们将购自Jackson实验室的CD11c Cre小鼠与Lkb1f/f小鼠杂交获得DCs特异性敲除Lkb1敲基因小鼠(CD11c CreLkb1f/f小鼠),然后采用PCR在基因水平鉴定小鼠DCs中Lkb1敲除情况;（2）流式细胞技术检测Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠淋巴器官CD8+Foxp3+Treg的比例及数量,同时检测脾脏、骨髓、外周血、肺部和肠道派尔集合淋巴结（PP结）中CD8+Foxp3+Treg的比例;（3）Helios和Nrp1是区别天然Treg和诱导型Treg特异性标志物,利用流式细胞技术检测Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg的Helios和Nrp1的表达,以此判断CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg扩增是来自于胸腺还是外周淋巴器官;利用CD44hiCD62Llow检测Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠中CD8+Foxp3+Treg的活化状态;同时检测Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠中CD8+Foxp3+Treg的ICOS和CD103表达,以此评估Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠中CD8+Foxp3+Treg的活化水平和免疫抑制能力;（4）流式细胞技术检测Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠中CD8+Foxp3+Treg的Ki-67表达,评估CD8+Foxp3+Treg的增殖能力;Annexin V-PI凋亡试剂盒检测Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠中CD8+CD25+Treg的凋亡水平,以此评估CD8+Foxp3+Treg的凋亡水平;（5）课题组前期研究工作表明Lkb1在DCs中可以通过抑制OX40/OX40L信号通路调控CD4+Foxp3+Treg的增殖,而本研究中我们利用流式细胞技术对CD8+T细胞相关亚群中OX40表达进行检测,同时检测Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Treg中OX40表达;另一方面,我们对Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠DCs细胞OX40L表达进行检测,以此来研究CD11c CreLkb1f/f小鼠介导DCs-T细胞相互作用OX40/OX40L信号通路变化;（6）为了进一步研究Lkb1特异性敲除的DCs对CD8+Foxp3+Treg的影响,我们利用LPS可以特异性敲低DCs中Lkb1蛋白表达的特点,对Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠分别进行脂多糖（LPS）皮下注射处理,并且以注射PBS的Lkb1f/f小鼠和CD11c CreLkb1f/f小鼠作对照,5天后检测小鼠淋巴结CD8+Foxp3+Treg,以此来验证Lkb1在DCs中对CD8+Foxp3+Treg扩增的作用。结果:（1）成功建立了DCs中特异性敲除Lkb1的敲基因小鼠(CD11c CreLkb1f/f小鼠),并且在基因水平上成功验证;（2）与Lkb1f/f小鼠为对照,CD11c CreLkb1f/f小鼠中淋巴结CD8+Foxp3+Treg的比例和数量均显著性增加,CD11c CreLkb1f/f小鼠其他器官如脾脏、肠系淋巴结、骨髓、外周血、肺部和PP结中CD8+Foxp3+Treg比例均显著提高,暗示在体内Lkb1缺失的DCs可以促进CD8+Foxp3+Treg显著扩增;（3）CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg高表达Nrp1和Helios,说明CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg增加主要来自于胸腺的天然Treg,而不是外周淋巴器官的诱导型Treg;CD8+Foxp3+Treg的表面活化标志物结果显示CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg高表达ICOS、CD44,说明CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg呈现活化的状态;CD103的表达与CD8+Foxp3+Treg免疫抑制功能相关,CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg高表达CD103暗示其免疫抑制功能可能增强;（4）Ki-67检测和凋亡实验结果表明CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg的增殖能力显著提高且凋亡水平下降,暗示CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg数量增加是其增殖能力提高和凋亡水平降低共同造成的;（5）OX40检测结果显示OX40在CD8+Foxp3+Treg的表达显著高于CD8+T细胞其他亚群,且CD11c CreLkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg中OX40的表达亦显著提高,CD11c CreLkb1f/f小鼠DCs中OX40L的表达亦显著高于Lkb1f/f小鼠,说明CD11c CreLkb1f/f小鼠体内介导DCs-CD8+Foxp3+Treg相互作用的OX40/OX40L信号通路显著上调,暗示Lkb1在DCs中可能是通过OX40/OX40L信号通路调控CD8+Foxp3+Treg数量;（6）LPS处理后的CD11c CreLkb1f/f小鼠和Lkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg检测结果:经过LPS处理的Lkb1f/f小鼠CD8+Foxp3+Treg水平显著高于未经LPS处理的Lkb1f/f小鼠;而经过LPS处理的CD11c CreLkb1f/f小鼠却与未经LPS处理的CD11c CreLkb1f/f小鼠无明显差别,进一步表明Lkb1在DCs中可以促进CD8+Foxp3+Treg的增殖和扩增。结论:（1）Lkb1缺失的DCs促进CD8+Foxp3+Treg的增殖,增加的CD8+Foxp3+Treg主要来源于胸腺的天然Treg;（2）Lkb1缺失的DCs会促使CD8+Foxp3+Treg处于激活的状态;（3）Lkb1在DCs中抑制CD8+Foxp3+Treg的增殖部分原因是通过抑制OX40/OX40L的信号通路调控的;（4）敲低DCs中Lkb1表达的LPS在体内可以促进CD8+Foxp3+Treg的扩增。目的:探讨Twist1在树突状细胞（dendritic cells,DCs）s中的抗肿瘤作用及其相关机制。方法:（1）为了研究Twist1对DCs的调控作用,我们首先利用CD11cCre小鼠与Twist1f/f小鼠杂交获得DCs特异性敲除Twist1小鼠(CD11cCre Twist1f/f小鼠),并且以Twist1f/f小鼠作为对照;（2）流式细胞技术分析CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠淋巴结DCs数量和表型,同时检测脾脏、肺部、肠道和肝脏的DCs比例。为了研究Twist1对DCs的活化影响,流式细胞技术检测DCs的细胞表面活化标记物MCHII、CD80和CD86的表达水平;（3）DCs的主要功能是启动T细胞免疫反应或者通过调节Treg的数量维持机体免疫稳态和免疫耐受性,所以我们利用流式细胞术检测CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠T细胞活化和Treg数量,同时细胞因子染色检测CD4+T细胞IL-4、IFN-γ、IL-17表达,以此评估CD11cCre Twist1f/f小鼠DCs中的免疫调节功能和免疫耐受功能;（4）黑色素瘤是一种皮肤恶性肿瘤,通过皮下注射小鼠黑色素瘤细胞B16-F12构建小鼠黑色素瘤肿瘤模型,并测量和记录肿瘤长（a）和宽（b）,利用公式V=0.5×a×b2计算小鼠肿瘤体积大小。CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠肿瘤模型下检测淋巴结DCs的比例、数量、活化标志物、T细胞活化情况和Treg数量的变化;（5）为了更深入研究Twist1在DCs抗肿瘤功能的分子机制,我们结合磁珠分选技术和流式分选技术分选CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠在稳态下和肿瘤模型下脾脏和淋巴结DCs,并进行RNA测序,利用生物信息学技术分析差异基因和基因富集分析;（6）为了更明确Twist1在DCs中的作用,分析CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠肿瘤浸润DCs、CD103+DCs数量和密度;（7）肿瘤内部DCs根据成熟度可以募集T细胞至肿瘤密度或者诱导Treg的生成,流式细胞术分析肿瘤浸润T数量和密度、T细胞活化和Treg数量;IFN-γ是重要的抗肿瘤因子,不但可以通过激活免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤,还可以抑制肿瘤细胞增殖,细胞因子染色方法分析肿瘤浸润T细胞IFN-γ的表达。结果:（1）CD11cCre Twist1f/f小鼠模型成功建立,并在基因水平上进行验证。CD11cCre Twist1f/f小鼠在外形看与Twist1f/f小鼠类似,没有明显的特征差异;（2）稳态下,细胞流式技术检测结果:CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠DCs的比例和数量差异均无统计学意义;DCs的活化标志物检测结果表明CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠DCs的MCHII、CD80和CD86的表达差异无统计学意义;（3）CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠淋巴结T细胞的活化和Treg的比例差异无统计学意义,其效应T细胞Th1、Th2和Th17亚群没有差异,相同鼠龄的小鼠体重无差异;（4）肿瘤模型下细胞流式技术检测结果:CD11cCre Twist1f/f小鼠的肿瘤体积显著大于Twist1f/f小鼠肿瘤体积,暗示Twist1缺失的DCs抗肿瘤免疫存在着缺陷;流式细胞技术检测CD11cCre Twist1f/f小鼠淋巴结c DCs的数量和比例均显著降低,但是c DC的亚群CD8a+DCs和CD11b+DCs占c DCs的比例差异没有统计学意义;而且CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠淋巴结DCs活化标志物MCHII、CD80和CD86表达亦无明显区别,T细胞活化和Treg比例差异无统计学意义;（5）稳态下和肿瘤模型中CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠DCs的转录谱分析结果表明:在肿瘤模型中CD11cCre Twist1f/f小鼠DCs活性氧（reactive oxygen species,ROS）相关通路显著激活,同时细胞凋亡通路显著上调;而稳态情况下CD11cCre Twist1f/f小鼠DCs中ROS通路和细胞凋亡通路差异无统计学意义;通过对ROS通路和细胞凋亡通路相关基因分析,发现在肿瘤模型CD11cCre Twist1f/f小鼠DCs中与ROS产生的相关基因显著上调,如Fas、Asns、Nurp1、Wnt11等,但是稳态情况下它们的表达差异无统计学意义;（6）肿瘤浸润淋巴细胞是衡量机体抗肿瘤的重要因素,肿瘤浸润淋巴细胞分析发现:CD11cCre Twist1f/f小鼠肿瘤浸润DCs显著减少,进一步说明Twist1缺失会导致DCs数量的减少;CD103是小鼠迁移DCs的标志物,CD103+DCs是肿瘤抗原呈递功能最强的DCs亚群,是将肿瘤抗原从肿瘤内部运输到“前哨”淋巴结并启动T细胞肿瘤免疫反应的最重要抗原呈递细胞,本研究中,CD11cCre Twist1f/f小鼠肿瘤内部CD103+DCs的密度显著低于Twist1f/f小鼠肿瘤内部CD103+DCs的密度,进一步说明Twist1缺失DCs存在着抗肿瘤能力的缺陷;（7）Treg是抑制机体抗肿瘤免疫反应的重要因素,但是CD11cCre Twist1f/f小鼠和Twist1f/f小鼠肿瘤内部Treg细胞数的比例差异无统计学意义。肿瘤浸润T细胞是机体抗肿瘤免疫反应最直接的体现,CD11cCre Twist1f/f小鼠肿瘤浸润T细胞显著降低,但是活化比例差异无统计学意义,这可能是肿瘤浸润DCs数量的降低导致DCs募集T细胞至肿瘤内部的能力下降;INF-γ是T细胞发挥抗肿瘤免疫的重要细胞因子,CD11cCre Twist1f/f小鼠肿瘤浸润CD4+T和CD8+T细胞INF-γ表达均显著下降,说明CD11cCre Twist1f/f小鼠肿瘤浸润CD4+T和CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能受损。结论:1)稳态情况下,DCs特异性敲除Twist1不影响DCs的数量和活化,不会导致自身免疫性疾病;2)稳态情况下,DCs特异性敲除Twist1不影响T细胞的活化、T效应细胞和Treg的自身稳定性;3)肿瘤模型中,DCs特异性敲除Twist1促使淋巴结及肿瘤浸润DCs数量减少;4)肿瘤模型中,CD11cCre Twist1f/f小鼠淋巴结和肿瘤浸润DCs降低可能是由于ROS产生增多诱导DCs凋亡所致;5)肿瘤浸润DCs细胞数量减少导致募集T细胞至肿瘤内部能力受损;6)Twist1缺失的DCs使肿瘤浸润T细胞分泌IFN-γ减少,导致T细胞抗肿瘤免疫功能受损。